El ADN circulante, o ADN libre, hace referencia a las moléculas de ADN de cadena doble o sencilla que se encuentran fuera de las células y pueden ser detectadas en diferentes fluidos del cuerpo como la sangre o la orina.
Hay, al menos, dos mecanismos mediante los cuales el ADN puede ser liberado en la circulación. Estos mecanismos se pueden distinguir como activos y pasivos. En el mecanismo pasivo las células apoptóticas y necróticas liberan ADN nuclear y mitocondrial en la circulación en procesos de destrucción celular. Bajo una condición fisiológica normal, los fagocitos infiltrados se encargan de limpiar los escombros apoptóticos y necróticos. Por tanto, en general los niveles de ADN circulante son bajos. Sin embargo, ciertas condiciones como una masa tumoral, el ejercicio o la inflamación extenuantes hacen que la limpieza no se produzca de forma correcta dejando una acumulación de detritos celulares, incluyendo el ADN que se libera a la sangre.
Alternativamente, la liberación activa de ADN ha sido determinada por estudios con líneas celulares cultivadas de distintos orígenes y se cree que pueden provocar la liberación espontánea de fragmentos de ADN en la circulación. Por tanto, sea cual sea el mecanismo involucrado en la liberación de ADN a la circulación, el incremento de la concentración de ADN circulante en distintas condiciones (patológicas o no) es debido en parte a la incapacidad del organismo para eliminar el ADN circulante.
Podemos encontrar un aumento de los niveles de ADN circulante en pacientes que poseen algunos tipos de condiciones patológicas y en mujeres embarazadas. En pacientes sanos podemos encontrarlo también, pero en concentraciones muy bajas.
Según su origen podemos encontrar tres tipos de ADN circulante: el ADN circulante normal, el ADN circulante fetal que proviene que en su mayoría proviene de la placenta y el ADN circulante tumoral que proviene de las células cancerosas.
El ADN circulante normal está formado por fragmentos de ADN degradados que han sido liberados al plasma sanguíneo. Estas moléculas provienen del proceso de apoptosis o necrosis de las células nucleadas normales del organismo, principalmente las células hematopoyéticas.
El ADN circulante fetal es el ADN proveniente del feto, que circula libremente en el torrente sanguíneo de la madre. Este ADN es de origen mayoritariamente placentario y se ha demostrado su presencia en etapas tempranas del desarrollo (a las 6 semanas de gestación) cuando aún no existe unión de la circulación feto-materna.
El ADN circulante tumoral se origina directamente desde el tumor o las células tumorales circulantes. El ADN tumoral circulante aumenta en cantidad conforme avanzan los estadios del cáncer. Las alteraciones moleculares caracterizan el ADN tumoral circulante y nos permite diferenciarlo del ADN circulante normal.
Aplicaciones clínicas del ADN circulante
El análisis del ADN circulante es una técnica poco invasiva y poco costosa por lo que numerosos estudios se centran en sus posibles aplicaciones clínicas. El análisis del ADN circulante no puede usarse de forma independiente a las técnicas invasivas. Sin embargo, se espera que estas aplicaciones clínicas puedan usarse cuando no sea estrictamente necesario emplear dichas técnicas, complementarlas o usarlas cuando no sea posible aplicar las técnicas invasivas.
1. Aplicaciones del ADN libre fetal
El ADN libre fetal permite diagnosticar y estudiar diferentes mutaciones puntuales, sin la necesidad de realizar procedimientos invasivos, que pongan en riesgo la salud de la madre o del niño. Este ADN comienza a estar presente en la sangre materna a partir de la sexta semana de embarazo. A pesar del alto grado de fragmentación, todo el genoma fetal se encuentra representado en el plasma materno. Esto implica que, a priori, cualquier defecto genético puede ser estudiado en el ADN libre fetal presente en la sangre materna.
Determinación del sexo fetal
El sexo del feto puede determinarse a través del análisis del ADN circulante fetal. Para ello, se analizan secuencias específicas del cromosoma Y, siguiendo un criterio de presencia/ausencia.
Determinación del factor RhD fetal
Esta prueba se realiza cuando la madre es Rh- con el fin de descartar la enfermedad hemolítica del recién nacido. Esta enfermedad se caracteriza porque el sistema inmune de la madre produce anticuerpos durante el embarazo que atacan los glóbulos rojos de su propio feto, cuando la madre y el bebé tienen tipos de sangre diferentes. La mayoría de los casos ocurren por diferencias entre el Rh materno y el fetal, en concreto cuando la madre es Rh- y el feto Rh+. En los casos en los que el feto sea Rh+ se lleva a cabo una inmunoprofilaxis que tiene como finalidad que la madre no produzca anticuerpos Rh que ataquen a los glóbulos rojos del feto. En cambio, si el feto es Rh- no es necesario aplicar ningún tratamiento.
La inclusión del análisis del ADN circulante para las gestantes Rh- ha permitido la supresión del tratamiento de inmunoprofilaxis en aquellas embarazadas cuyo feto es Rh- y, por tanto, no existe riesgo de desarrollar la enfermedad hemolítica del recién nacido.
Determinación de enfermedades monogénicas
El análisis del ADN circulante fetal solo se pueden determinar las enfermedades transmitidas por el padre, puesto que es con los mecanismos actuales no es posible diferenciar el ADN circulante materno de las copias de ADN fetal procedentes de su madre. En este tipo de enfermedades podemos encontrar enfermedades de herencia dominante y recesiva.
Detección de enfermedades de herencia dominante: esta prueba es utilizada en aquellas parejas en las que el varón es portador de una mutación asociada a una enfermedad de herencia dominante, la ausencia de dicho defecto en el genoma materno permite realizar el diagnóstico fetal en sangre materna. La presencia o ausencia del alelo mutante paterno en sangre materna nos permitirá concluir si el feto es afecto o sano respectivamente para dicha enfermedad. El ADN circulante también es útil para analizar fetos con sospecha ecográfica de una enfermedad dominante que puede haber sido causada por una mutación de novo.
Detección de enfermedades de herencia recesiva: en este caso la ausencia del gen recesivo paterno en el feto puede evitar la necesidad de realizar un diagnóstico prenatal invasivo. En el caso de detectar este gen de origen paterno en el ADN circulante fetal será necesario un diagnóstico prenatal invasivo para conocer el estado del feto con respecto al gen materno concluyendo de esta forma si el feto es únicamente portador o está afectado.
Estudio de aneuploidías fetales
Las aneuploidías son alteraciones del número de cromosomas que implican pérdida o ganancia de cromosomas completos. El diagnóstico prenatal de las aneuploidías fetales requiere procedimientos invasivos, los cuales conllevan riesgos y son caros. Por tanto, las estrategias se han centrado en el desarrollo de métodos efectivos de cribado. El análisis del ADN circulante fetal nos permite detectar las trisomías 13, 18 y 21. Se ha alcanzado una tasa de detección del 99% y la tasa de falsos positivos es menor a 0,1%. Sin embargo, es importante destacar que a día de hoy no se aconseja usar esta técnica como herramienta diagnóstica, sino que se defiende su uso como herramienta de cribado.
2. Aplicaciones del ADN circulante normal
Biomarcador para el rechazo del trasplante de órganos sólidos
El ADN circulante normal puede ser utilizado para hacer un seguimiento de la evolución de un órgano tras su implantación en el paciente. Para ello partimos de la base de que un rechazo provocará una reacción inmune del receptor contra el órgano implantado, que llevará a una alta tasa de muerte en las células del órgano implantado. Como consecuencia de esta muerte celular se libera ADN al torrente sanguíneo.
Para hacer el seguimiento se hace una cuantificación del ADN libre del injerto, permitiendo detectar episodios de rechazo en estadios tempranos, cuando otras técnicas de diagnóstico no son efectivas. Se trata de un método no invasivo que permite la monitorización a intervalos deseados para detectar rechazos en los primeros pasos y evitar un rechazo posterior total.
Este biomarcador podría ser particularmente valioso para minimizar la inmunosupresión. En la actualidad, se están llevando a cabo estudios en hígado, corazón y riñón para establecer este seguimiento en las clínicas.
Monitorización del tratamiento del lupus eritematoso sistémico
El lupus eritematoso sistémico (LES) una enfermedad autoinmune crónica. Al igual que en otras enfermedades autoinmunes, estudios recientes han demostrado porcentajes elevados de ADN circulante en los pacientes con LES. Debido a que la mayoría de estos trastornos se asocian con mayores tasas de eventos de muerte celular, por apoptosis o necrosis, estos mecanismos se consideran las principales fuentes de ADN circulante. También se ha observado una disminución del nivel de ADN circulante después de la terapia en aquellos pacientes que respondieron al tratamiento. Esto abre la posibilidad de utilizar este ADN como marcador del seguimiento del tratamiento en el LES.
Pronóstico y monitorización de traumas
El ADN circulante es un posible marcador de muerte celular por lo que existe la posibilidad de usar las altas concentraciones de ADN libre que teóricamente resultan de las lesiones y muerte celular ocasionadas por algún trauma. Por ejemplo, se han estudiado concentraciones de ADN en la sangre de personas a las que se les diagnosticó infarto de miocardio, condición que se inicia con una falta de oxígeno y que si se prolongar resulta en necrosis. En ellos se observaron niveles más altos de ADN circulante que en las encontradas en personas sanas. Además, las concentraciones elevadas de ADN circulante pudieron relacionarse con la severidad de la lesión y el desarrollo de complicaciones post-traumáticas. Por tanto, el ADN circulante tiene el potencial clínico para ser utilizado en el pronóstico y supervisión de personas que han padecido algún tipo de lesión física.
3. Aplicaciones del ADN circulante tumoral
El ADN circulante tumoral está formado por moléculas de ADN liberadas por los tumores en los fluidos corporales. El análisis de este ADN puede revelar gran parte de la misma información que dan las biopsias de tejido. Para muchos tumores, una biopsia de tejido es todo un reto en cuanto a que es costosa, dolorosa o potencialmente arriesgada para el paciente.
La biopsia líquida se basa en el análisis del ADN tumoral circulante en sangre, la sangre es un fluido muy accesible y su extracción es muy poco invasiva. Debido a que el ADN tumoral circulante refleja el genoma tumoral tiene un gran potencial como herramienta clínica. Además, con las nuevas tecnologías, la sensibilidad y especificidad de la detección de ADN tumoral circulante ha mejorado y facilita el papel del diagnóstico del ADN tumoral circulante en la práctica clínica.
Detección temprana de cáncer
Una aplicación potencial de las biopsias líquidas basadas en ADN tumoral circulante es la detección de cáncer en estados tempranos. En varios estudios las biopsias líquidas han detectado ADN tumoral circulante en muestras de sangre cogidas de pacientes meses antes de que estos desarrollaran la enfermedad.
El problema, sin embargo, es que en algunas ocasiones se han producido falsos positivos: la detección de ADN canceroso cuando el cáncer no se desarrolla posteriormente. Además, los tumores detectados en fases tempranas puede que no crezcan mucho o crecer de forma tan lenta que nunca lleguen a hacer daño al paciente. Es decir, el tratamiento de estos tumores puede ser más perjudicial que beneficioso. Por ello, el diagnóstico empleando únicamente biopsia líquida no se ha validado aún.
Detección de recurrencia en cáncer localizado
Otra potencial aplicación clínica para las biopsias líquidas es la detección temprana de la recaída de un cáncer localizado después de un tratamiento.
Hay estudios que indican que monitorizando las alteraciones genéticas específicas del tumor en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal tras la cirugía es posible identificar recurrencia de la enfermedad con casi un 100% de sensibilidad y especificidad. Pacientes con una enfermedad residual han sido también identificados en base a las alteraciones del ADN circulante persistentes asociadas a tumores.
Predicción de la respuesta al tratamiento en cáncer metastásico
Se espera que el análisis de ADN tumoral circulante pueda ofrecer apoyo en la toma de decisiones respecto a tratamientos de medicina de precisión, mediante la identificación de características moleculares únicas de un individuo con cáncer metastásico. En varios estudios de investigación, las biopsias líquidas han señalado mutaciones de ADN tumoral circulante que pueden ser usadas potencialmente para determinar un tratamiento óptimo. Además, un número cada vez mayor de alteraciones genéticas están siendo probadas como biomarcadores putativos predictivos en ensayos clínicos de terapias novedosas anticáncer.
La detección de un número creciente de copias génicas también puede ser usada para evaluar la amplificación de otros genes para predecir una respuesta al tratamiento.
Identificación de mecanismos de resistencia en cánceres refractarios
El desarrollo de resistencia secundaria, adquirida, es común en la mayoría de pacientes tratados con agentes dirigidos. Conceptualmente, la identificación de mecanismos de resistencia secundaria puede permitir el diseño de unas líneas de terapia adicionales. Cada paciente que se vuelve resistente a una terapia en particular debe hacerse una biopsia de tejido. Posteriormente, mediante herramientas moleculares se compara el tejido pre-terapia con el post-terapia. Este análisis se lleva a cabo en estados avanzados del cáncer y en el mejor de los casos ofrecerá un perfil del clon resistente predominante de la lesión bajo examen.
Hay estudios que han demostrado que la detección de clones emergentes resistentes, mediante la presencia de alteraciones genéticas tumorales asociadas en sangre, identifican la resistencia al tratamiento hasta 10 meses antes de los métodos radiológicos.
Monitorización de la respuesta en cáncer metastásico
Las biopsias líquidas basadas en ADN tumoral circulante, al ser fácilmente repetibles y al no ser invasivas, pueden ser útiles para la monitorización de la respuesta en pacientes a terapias durante el tratamiento y después de que se haya completado. Los clínicos esperan que el seguimiento de la respuesta a un tratamiento pueda permitir ajustes en tiempo real. En otras palabras, el tratamiento puede detenerse o ajustarse si las pruebas indican que no está funcionando correctamente.
En conclusión, todos los descubrimientos en relación con el ADN circulante y su posible relación con algunas patologías han originado un gran interés de los investigadores en el potencial del ADN circulante. Sus principales enfoques son de cara al diagnóstico, pronóstico y seguimiento de distintas condiciones clínicas. El primer objetivo al surgir este campo de investigación era llegar a sustituir los diagnósticos invasivos. Para alcanzarlo se debería conseguir unos niveles de sensibilidad y especificidad del 100%. Al no alcanzarse estos valores, se está empezando a plantear el diagnóstico no invasivo, ya no como una técnica de diagnóstico, sino como una herramienta de cribado.
Es necesario que se realicen mayores avances tecnológicos, se unifiquen las metodologías empleadas y se aumente la investigación en el campo del ADN circulante. Su uso podrá ser muy pronto una imprescindible y poderosa herramienta clínica en la evaluación del cáncer, además de otras enfermedades y condiciones de salud: complicaciones del embarazo, trasplantes y traumatismo.
Bibliografía:
Beck, J., Oellerich, M., Schulz, U., Schauerte, V., Reinhard, L., Fuchs, U., Knabbe, C., Zittermann, A., Olbricht, C., Gummert, J., Shipkova, M., Birschmann, I., Wieland, E. and Schütz, E. (2015). Donor-Derived Cell-Free DNA Is a Novel Universal Biomarker for Allograft Rejection in Solid Organ Transplantation. Transplantation Proceedings, 47(8), pp.2400-2403.
Bronkhorst, A., Aucamp, J. and Pretorius, P. (2015). Cell-free DNA: Preanalytical variables. Clinica Chimica Acta, 450, pp.243-253.
BUSTAMANTE-ARAGONES, A., RODRIGUEZ DE ALBA, M., GONZALEZ-GONZALEZ, C., TRUJILLO-TIEBAS, M., DIEGO-ALVAREZ, D., VALLESPIN, E., PLAZA, J., AYUSO, C. and RAMOS, C. (2008). Foetal sex determination in maternal blood from the seventh week of gestation and its role in diagnosing haemophilia in the foetuses of female carriers. Haemophilia, 14(3), pp.593-598.
Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F. and Bardelli, A. (2013). Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology, 10(8), pp.472-484.
En.wikipedia.org. (2017). Circulating tumor DNA. [online] Available at: https://en.wikipedia.org/wiki/Circulating_tumor_DNA#Current_applications_of_ctDNA [Accessed 3 Dec. 2017].
Gratacós, E. and Nicolaides, K. (2014). Clinical Perspective of Cell-Free DNA Testing for Fetal Aneuploidies. Fetal Diagnosis and Therapy, 35(3), pp.151-155.
Hendy, O., Motalib, T., El Shafie, M., Khalaf, F., Kotb, S., Khalil, A. and Ali, S. (2016). Circulating cell free DNA as a predictor of systemic lupus erythematosus severity and monitoring of therapy. Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 17(1), pp.79-85.
Hubel, A. (2017). El papel de las biopsias líquidas en la detección del cáncer. [Blog] Genética médica blog. Available at: http://revistageneticamedica.com/blog/biopsia-liquida-deteccion-cancer/ [Accessed 28 Nov. 2017].
Husain, H. and Velculescu, V. (2017). Cancer DNA in the Circulation. JAMA, 318(13), p.1272.
KARACHALIOU, N., MAYO-DE-LAS-CASAS, C., MOLINA-VILA, M.A. and ROSELL, R., 2015. Real-time liquid biopsies become a reality in cancer treatment. Annals of translational medicine, 3(3), pp. 36.
Martínez-Ezquerro JD e tal (2008).. El ADN circulante y su potencial clínico. Ciencia. Revista de la Academia Mexicana de Ciencias. 59(1): 64-73
National Cancer Institute. (2017). Liquid Biopsy: Using Tumor DNA in Blood to Aid Cancer Care. [online] Available at: https://www.cancer.gov/news-events/cancer-currents-blog/2017/liquid-biopsy-detects-treats-cancer [Accessed 5 Dec. 2017].
RH, I. (2017). Incompatibilidad RH: MedlinePlus enciclopedia médica. [online] Medlineplus.gov. Available at: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/001600.htm [Accessed 10 Dec. 2017].
Rodríguez de Alba, M., Bustamante-Aragonés, A., Perlado, S., Trujillo-Tiebas, M., Díaz-Recasens, J., Plaza-Arranz, J. and Ramos, C. (2012). Diagnóstico prenatal no invasivo: presente y futuro de mano de las nuevas tecnologías. Diagnóstico Prenatal, 23(2), pp.67-75.
Volik, S., Alcaide, M., Morin, R. and Collins, C. (2016). Cell-free DNA (cfDNA): Clinical Significance and Utility in Cancer Shaped By Emerging Technologies. Molecular Cancer Research, 14(10), pp.898-908.
Husain, H. and Velculescu, V. (2017). Cancer DNA in the Circulation. JAMA, 318(13), p.1272.
Autor: Ana Hubel
