SARS-CoV-2: ¿Cómo detectar el nuevo coronavirus con ayuda de la genética?

Rubén Megía González

Hace poco publicamos en nuestro blog un nuevo post sobre la técnica bioquímica de la PCR, en el que explicamos en qué consiste. En este post os mostraré una de las variantes más utilizadas de la PCR, la RT-PCR cuantitativa, y cómo puede utilizarse para diagnosticar la infección por el coronavirus SARS-CoV-2.

 

Coronavirus SARS-CoV-2

El coronavirus SARS-CoV-2 es una especie de virus que apareció a finales de 2019 en el territorio de Wuhan, en China. En humanos este virus es capaz de causar diferentes afecciones respiratorias agudas y neumonías.

Los coronavirus son virus de ARN monocatenario positivo recubiertos por una estructura de glicoproteínas y lípidos. Eso quiere decir que, a diferencia de nosotros, los humanos, el SARS-CoV-2 tiene su material genético en forma de ARN. Pero… ¿la PCR sólo era capaz de amplificar el ADN, no? Cierto, las ADN polimerasas sólo pueden utilizar el ADN como molde y no el ARN. Entonces  ¿cómo es posible utilizar la PCR para detectar la infección por coronavirus? Pues… utilizando una variante de la PCR estándar, la RT-PCR, que se vale de la ayuda de un enzima muy particular, la transcriptasa inversa.

 

Obtención de la muestra y conversión de ARN a ADN mediante Transcriptasa inversa

La transcriptasa inversa es una ADN polimerasa de origen vírico un tanto especial. Mientras el resto de ADN polimerasas sólo puede obtener ADN a partir de una cadena de ADN, la transcriptasa inversa puede sintetizar ADN a partir de una molécula de ARN. ¡Como el de SARS-CoV-2!

Por tanto, el primer paso para detectar la infección por SARS-CoV-2 mediante PCR es la conversión del ARN monocatenario viral en ADN . Para ello, en primer lugar, se obtiene el material genético del virus a partir de un frotis de nariz o garganta del paciente a diagnosticar y se purifica. Debemos tener en cuenta que en la muestra estamos recogiendo también ARN humano, ARN bacteriano e incluso ARN de otros virus. ¡Menudo lío!

Acto seguido, la muestra de ARN obtenida y purificada se mezcla con la transcriptasa inversa (y otros reactivos), para obtener cadenas de ADN, que podemos cuantificar mediante una PCR cuantitativa. Aquí habrá ADN de muchos orígenes (humano, vírico y bacteriano), pero no todo se amplificará en la PCR, ya que es una técnica dirigida a ciertas secuencias específicas (en este caso, secuencias del ADN retrotranscrito del virus).

 

PCR cuantitativa

Como os comentaba en el post anterior sobre la técnica de la PCR, la PCR cuantitativa es una variante de la PCR que nos permite medir en tiempo real la cantidad de fragmentos de ADN que se van produciendo. Para poder cuantificar la muestra de un paciente en este tipo de PCR, se añaden al tubo de ensayo sondas que se unen únicamente a secuencias específicas del ADN retrotranscrito del virus y emiten fluorescencia. Por tanto, a mayor fluorescencia en la muestra, mayor cantidad de copias del ADN obtenido mediante la retrotranscripción del virus SARS-CoV-2.

Análisis de Resultados

Una vez se está produciendo la reacción de la PCR cuantitativa de la muestra purificada y retrotranscrita del paciente, podemos obtener los siguientes resultados:

Presencia de fluorescencia en la PCR cuantitativa:

Si se detecta un aumento de la fluorescencia durante la reacción de PCR, estamos ante un claro indicio de la presencia de SARS–CoV-2 en el paciente. Recordad que, en esta prueba diagnóstica, la fluorescencia es producto de la amplificación del ADN que hemos obtenido de la retrotranscripción del ARN del virus.

En este caso, diríamos que la prueba ha dado positivo, es decir, el paciente se encuentra infectado, en cierta medida, por SARS-CoV-2.

 

Ausencia de fluorescencia en la PCR cuantitativa:

Es posible que la prueba no detecte un aumento de la fluorescencia durante la reacción de PCR. En este caso, diríamos que la prueba ha resultado negativa y, por tanto, el paciente no se encuentra infectado por el virus SARS-CoV-2.

Limitaciones de la prueba mediante RT-PCR cuantitativa

Aunque la RT-PCR cuantitativa es una técnica muy interesante a la hora de detectar la infección por SARS-CoV-2 de los pacientes posiblemente infectados, presenta varias limitaciones asociadas que la hacen menos efectiva de lo que debería. 

La primera de las limitaciones de las pruebas diagnósticas de SARS-CoV-2 mediante RT-PCR cuantitativa es que solo pueden determinar la infección por SARS-CoV-2 en el momento de la prueba. Esto quiere decir que, utilizando esta técnica, no podemos saber si un paciente estaba infectado días antes de la prueba.

Otra de las limitaciones de la RT-PCR cuantitativa es la velocidad a la que se lleva a cabo. Aunque, por lo general, la PCR es una técnica bastante rápida para amplificar muestras de ADN, se demora varias horas hasta poder establecer unos resultados. El diagnóstico mediante este método es, por tanto, lento en la situación actual, en la que se necesitan resultados rápidos para poder controlar a los pacientes infectados.

Por último, aunque la RT-PCR cuantitativa es una técnica relativamente fiable, se pueden producir falsos positivos o falsos negativos. Se denominan falsos negativos a todos aquellos resultados negativos de pacientes infectados por SARS-CoV-2, mientras que se considera falso positivo a un resultado positivo de un paciente no infectado. Estos errores en el diagnóstico pueden determinar incorrectamente el seguimiento de los pacientes.

 

Test alternativos

Para suplir las limitaciones de la RT-PCR cuantitativa para el diagnóstico de infecciones de SARS-CoV-2, se están desarrollando diferentes técnicas de diagnóstico alternativas. Es el caso de los test de anticuerpos que se utilizan en el diagnóstico de SARS-CoV-2 o los test basados en CRISPR-Cas13 que se están desarrollando.

 

Test de anticuerpos

Los test de anticuerpos para la detección de SARS-CoV-2 son pruebas diagnósticas capaces de determinar si un paciente ha sido infectado y ya se encuentra inmunizado. Este tipo de pruebas consigue detectar los anticuerpos que el sistema inmunitario del paciente ha generado contra el virus. Una de las grandes ventajas de este test es el tiempo en el que se llevan a cabo, ya que solo se tardan unos 15 minutos en obtener resultados. 

El problema principal de este tipo de test es que no pueden determinar una infección reciente del paciente. Es decir, que si el paciente acaba de ser infectado por SARS-CoV-2  puede dar un resultado falso negativo, ya que la persona todavía no ha tenido tiempo para desarrollar anticuerpos frente al virus. Por ello, se recomienda como prueba complementaria a la RT-PCR cuantitativa.

 

Test basados en CRISPR-Cas13

Hace unos años (exactamente en 2017) un equipo de investigadores publicó en la revista Science una herramienta excelente que utilizaba CRISPR para detectar ácidos nucleicos. Estos científicos llamaron a esta técnica “SHERLOCK”. Actualmente se está desarrollando un test de detección de SARS-CoV-2 a partir de SHERLOCK. Sin embargo, todavía no se ha probado mediante ensayos clínicos, por lo que no podríamos considerarlo todavía una técnica de diagnóstico.

En este tipo de pruebas, gracias al sistema CRISPR-Cas13, podemos detectar la infección por SARS-CoV-2 a partir de una muestra de una forma rápida y visual. En este caso, el sistema se encuentra en laminillas de papel que, al ser sumergidas en una muestra se colorea, indicando la presencia de moléculas de ARN de SARS-CoV-2. Para que os hagáis una idea, visualmente es similar a una prueba de embarazo.

 

Otros test

Además de los test anteriores, algunos centros europeos, entre los que figura el Instituto Catalán de Nanociencia y Nanotecnología, están trabajando en un nuevo dispositivo que se espera que detecte la infección por coronavirus en menos de 30 minutos. Este nuevo dispositivo, al que los autores han llamado “CoNVat” se basa en tecnologia de microchip y guías de onda interferométricas (nanotecnología óptica) para detectar el virus.

 

Bibliografia:

Enabling coronavirus detection using CRISPR-Cas13: Open-access SHERLOCK research protocols and design resources. Broad Institute: https://www.broadinstitute.org/news/enabling-coronavirus-detection-using-crispr-cas13-open-access-sherlock-research-protocols-and

Así son las pruebas PCR que se utilizan para detectar el coronavirus. Agencia SINC:

https://www.agenciasinc.es/Noticias/Asi-son-las-pruebas-de-secuenciacion-que-se-utilizan-para-detectar-el-coronavirus

Arranca el desarrollo de un nuevo y rápido detector del coronavirus. Agencia SINC:

https://www.agenciasinc.es/Noticias/Arranca-el-desarrollo-de-un-nuevo-y-rapido-detector-del-coronavirus?fbclid=IwAR2tciPhMJNVki2MROEbPQojXSzL2b7_fp8fIGEgB7JZ4z1H51ZWjT77WiU

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CON ESTE ARTÍCULO

32 comentarios de “SARS-CoV-2: ¿Cómo detectar el nuevo coronavirus con ayuda de la genética?

  1. Heriberto Cuevas Lizárraga dice:

    muy didáctica la manera de describir estas nuevas herramientas de laboratorio que están de actualidad por parte del autor. Atte. H. Cuevas

  2. Leticia dice:

    En el 6to párrafo, ¿No debería decir: «Acto seguido, la muestra de ARN obtenida…» en lugar de «ADN»? Porque la muestra que se extrae del paciente y que luego purifica y mezcla con transcriptasa inversa es de ARN, no ADN. Saludos.

  3. Dr. Ernesto González González dice:

    Pienso que los materiales de genética que han sido puesto al alcance de los médicos acerca del nuevo coronavirus, ha sido muyyyy útil, y nos acerca más al mundo rico de la genética tan lejano a veces para nosotros los internistas en algunas circunstancias como esta. el papel de ustedes es digno de admirar y nos fortalece desde el punto de vista médico , enriquece nuestros conocimientos y con mucha satisfacción los felicito. estoy a diario al pendiente de lo que se publica en Genotipia desde hace mucho tiempo y siempre me he nutrido de sus aportes para ganar en cultura genética que lamentablemente a veces nos falta, porque considero que es una hermosa y útil especialidad en todos los campos de las ciencias. Felicitaciones.

  4. Roeris dice:

    Es realmente muy útil esta explicación, para conocer realmente como se aprovechan los mecanismos bioquímicos en algo tan importante como la detección del virus. Muchas Gracias por publicaciones de este tipo en tiempos de coronavirus.

  5. Pedro dice:

    Comentáis que “no todo se amplificará en la PCR, ya que es una técnica dirigida a ciertas secuencias específicas (en este caso, secuencias del ADN retrotranscrito del virus).”

    Pero…”aunque la RT-PCR cuantitativa es una técnica relativamente fiable, se pueden producir falsos positivos o falsos negativos”.

    ¿Cómo sabes que estás ante un falso positivo o negativo?
    ¿En qué porcentaje puede una PCR ser inespecífica y puede unirse a cualquier molécula de DNA, RNA contaminante o productos de amplificación inespecífica, aumentando la probabilidad de producir falsos positivos? ¿Podría unirse por error a una molécula de RNA de exosoma?

    • Genotipia dice:

      Hola Pedro:

      Normalmente en cada ensayo se incluyen controles que ayudan a determinar si puede haber habido algún problema en la reacción o en alguno de los reactivos. Por ejemplo se incluyen muestras que se sabe que tienen que dar positivo o negativo. A través de este tipo de pruebas en las que se conoce a priori el resultado se pueden estima la precisión y especificidad de análisis. Y se sabe la frecuencia con la que pueden producirse falsos positivos o falsos negativos. Cuando se utiliza la muestra de una persona, sin embargo, descartado cualquier problema en los reactivos o reacción (que se comprueba con los controles) no se puede saber con exactitud si es falso el resultado. La única posibilidad sería repetirlo e incluso podría ser que fuera positivo pero la cantidad de virus no llegara al mínimo detectado por la prueba.

      Respecto del porcentaje de una PCR a ser inespecífica, depende de varios factores. Las pruebas de detección diagnóstica se diseñan para ser muy específicas. EN primer lugar los cebadores son específicos del fragmento que se va a amplificar. Se pone mucho cuidado en ese diseño para optimizar que no amplifiquen otra cosa. Además, se utilizan temperaturas que favorezcan que solo se reconozcan moléculas de ADN complementario. Se intenta siempre minimizar que se una a otras secuencias. Se podría unir a ARN de exosoma si la secuencia es complementaria. Depende de la secuencia, no del origen del ARN.

      ¡Un saludo!

  6. Reyes dice:

    Buenas noches,necesito que alguien me ayude,le explico,me he hecho el test serológico y me ha dado positivo(no tengo sintomas),a los 12 días me lo he vuelto hacer pero uno cuantitativo y me dan el resultado y me dicen que ni lo tengo ni lo he tenido y me quedo de cuadros,igg 0.09 y igm 0.75.Nose que pensar, puede ser que no haya desarrollado anticuerpos y no sea inmune aunque lo hubiera tenido?Muchísimas gracias(esto es un sin vivir).

  7. José Angel dice:

    Muchas gracias por esa publicación tan esclarecedora.
    Cuál es la probabilidad de un falso positivo y la de un falso negativo para este metodo diagnóstico?

  8. JIMENA dice:

    Buena la información en relación al PCR, pero se puede declarar una pandemia sin tener la secuencia completa del virus?? y sin microscopías electrónicas, que deberían ser miles.. tengo esa duda,o confusión, que nadie me ha sabido responder!!

  9. EDINSON MURILLO SEVILLANO dice:

    FELICITACIONES RUBEN,POR TAN VALIOSA INVESTIGACION CIENTIFICA , QUE NOS DESPEJA DUDAS ACERCA DE ESTA PANDEMIA. SALUDOS DESDE MACHALA ECUADOR. LCDO. EDINSON MURILLO SEVILLANO

  10. mirna leyton dice:

    Muy bien explicado, me asalta la duda en los test de IGG e IGM si es comprobada por esta infección exclusiva, quiere decir, si me hago un test rapido de IGG y me aparecen estos AC.. esto solo indica que estuve frente a una infección y mi cuerpo reaccionó; pero no necesariamente al sars-cov2

    • Genotipia dice:

      Hola Mirna:
      Los test son específicos para agente infeccioso. No obstante, habrá que tener en cuenta la sensibilidad y precisión de las pruebas rápidas que es menor que la de las pruebas ELISA tradicionales.

      ¡Un saludo!

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