INTRODUCCIÓN
La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad monogénica causada por mutaciones en el gen codificante de la proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística (CFTR, por sus siglas en inglés) (OMIM: 602421). Los pacientes con FQ presentan una gran variabilidad clínica, en sus formas más severas, se generan alteraciones que confieren una susceptibilidad anormal para colonización endobronquial crónica por bacterias, como Pseudomonas aeruginosa, entre otras (Agudelo et al., 2008).
La enfermedad pulmonar, principal causa de muerte en estos pacientes, está asociada a la inflamación producto de las infecciones bacterianas y a la variabilidad fenotípica que se presenta en esta enfermedad. La presencia de distintas mutaciones en el gen CFTR, la acción de genes moduladores y la incidencia de factores medioambientales, dificultan el diagnóstico y el tratamiento de estos pacientes (Gallati, 2014; Orozco et al., 2006). La identificación de polimorfismos en genes moduladores de la fisiopatología de la enfermedad y que condicionan el pronóstico así como la variabilidad clínica de la FQ es clave para profundizar en el conocimiento de la patogenia de la enfermedad e identificar potenciales dianas terapéuticas en otros genes (Gallati, 2014), facilitando la aplicación de tratamientos más individualizados en pacientes con FQ (Orozco et al., 2006).
Los receptores tipo toll (TLRs) implicados en la respuesta inmunitaria innata han sido estudiados como genes moduladores de la FQ, específicamente los receptores TLR5 y TLR9, por su participación en procesos infecciosos mediante el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (Greene et al., 2005; Haerynck et al., 2013). La variante TLR5 c.1174C>T codifica un codón de parada prematuro (p.Arg392Stop), Blohmke et. al. (Blohmke et al., 2010) describió la reducción del 45,5-76,3% en la respuesta anti-inflamatoria a flagelina en presencia de esta variante, sugiriendo al gen TLR5 como un gen modulador de la FQ. Este mismo grupo, describe una asociación ente la presencia de la variante c.1174C>T y un mayor índice de masa corporal en estos pacientes, relacionándola con mejoras en la salud de los pacientes con FQ (Blohmke et al., 2010). El TLR5 también es considerado como un posible blanco anti-inflamatorio (Gallati, 2014), de potencial uso en estos pacientes.
Se ha descrito que la activación de TLR9 por sus agonistas, induce respuestas proinflamatorias en líneas celulares de epitelio respiratorio de FQ (Greene et al., 2005). La deficiencia en la capacidad de defensa del hospedador es capaz de modificar el defecto básico en FQ, que se define como un deterioro de la conductancia de cloruro en el epitelio mediada por la proteína CFTR (Stanke et al., 2011), una asociación moderada entre el genotipo del receptor TLR9 y el fenotipo del defecto básico de FQ fue confirmada por el grupo de Stanke et al (Stanke et al., 2008). Varios estudios han examinado la funcionalidad del SNP c.-1486T>C en el gen TLR9, demostrando que en condiciones basales el alelo C del SNP c.-1486T>C está asociado con una menor expresión del receptor TLR9 (Elmaagacli et al., 2009; Tao et al., 2007). Estos resultados confirman otros estudios que evidencian la existencia de señalización cruzada entre el sistema inmunitario y las propiedades secretoras de las células epiteliales (Galietta et al., 2004). Adicionalmente, se han diseñado agonistas de TLR9 que pudieran ser utilizados como adyuvantes de vacunas eficaces en enfermedades infecciosas (Jurk & Vollmer, 2007), de potencial uso en individuos con FQ.
Al considerar que polimorfismos en los genes de los receptores TLR5 y TLR9 puedan contribuir con el conocimiento de la fisiopatología y variabilidad fenotípica de la FQ, nos planteamos como objetivo determinar la presencia de la variante c.1174C>T (rs5744168) del gen TLR5 y la variante c.-1486T>C (rs187084) del gen TLR9 en individuos venezolanos con fibrosis quística con el fin de determinar si pueden ser considerados SNPs candidatos a evaluar en estos genes moduladores de FQ en pacientes venezolanos.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Pacientes
De un registro de 110 pacientes de igual número de familias no vinculadas registradas en el Programa Nacional de FQ del Ministerio de Salud de Venezuela, participaron en este estudio 41 individuos, de edad promedio: 9 años (rango de edad 1-27años), 17 pacientes de sexo femenino (41,46%) y 24 de sexo masculino (58,64%), nacidos en Venezuela, con diagnóstico clínico de fibrosis quística, algunos datos epidemiológicos y clínicos se describen en la tabla 1. Estos pacientes poseen una historia médica que cumplen con los criterios clínicos establecidos para el diagnóstico clínico de fibrosis quística sugeridos según estándares internacionales (Farrell et al., 2008), presentando síntomas y signos clásicos de la enfermedad así como resultados de exámenes de laboratorio confirmatorios.
Todos los individuos participantes en el estudio y/o su representante legal (en caso de los menores de edad) firmaron un consentimiento informado. Dicho consentimiento fue aprobado por el Comité de Bioética del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas y el de los centros médicos. La información personal, social, clínica y genética de los individuos participantes fue registrada y archivada bajo formatos de estándares internacionales.
Tabla 1. Datos epidemiológicos y clínicos de los pacientes incluidos en el estudio.
| Paciente | Sexo | Edad (años) | Valor Test sudor (mmol/L) | N° mutaciones CFTR detectadas | |
| 1er resultado | 2do resultado | ||||
| 1 | M | 1 | 21 | – | 1 |
| 2 | F | 6 | 39 | 37 | 0 |
| 3 | F | 18 | 40 | 34 | 1 |
| 4 | M | 14 | 62 | 62 | 0 |
| 5 | M | 3 | 63 | – | 2 |
| 6 | M | 8 | 69 | 24 | 2 |
| 7 | F | 5 | 70 | 68 | 2 |
| 8 | M | 27 | 78 | – | 1 |
| 9 | F | 4 | 78 | 78 | 1 |
| 10 | M | 4 | 82 | – | 2 |
| 11 | F | 1 | 82 | – | 2 |
| 12 | F | 1 | 82 | – | 2 |
| 13 | M | 2 | 83 | 72 | 2 |
| 14 | M | 4 | 89 | 88 | 2 |
| 15 | M | 14 | 91 | 80 | 1 |
| 16 | M | 14 | 92 | 76 | 2 |
| 17 | M | 14 | 92 | 79 | 1 |
| 18 | M | 3 | 93 | 84 | 2 |
| 19 | M | 13 | 96 | 66 | 0 |
| 20 | F | 3 | 106 | 98 | 2 |
| 21 | M | 10 | 107 | – | 1 |
| 22 | F | 6 | 109 | 69 | 2 |
| 23 | F | 20 | 109 | – | 2 |
| 24 | F | 5 | 111 | 108 | 2 |
| 25 | M | 6 | 111 | 87 | 2 |
| 26 | F | 12 | 113 | 100 | 2 |
| 27 | M | 4 | 115 | 100 | 2 |
| 28 | M | 4 | 117 | 92 | 2 |
| 29 | F | 10 | 124 | – | 1 |
| 30 | M | 5 | 129 | 109 | 2 |
| 31 | F | 14 | 134 | 127 | 1 |
| 32 | F | 2 | 138 | 125 | 2 |
| 33 | M | 16 | 138 | 116 | 2 |
| 34 | F | 23 | 139 | 119 | 2 |
| 35 | M | 14 | 152 | 152 | 2 |
| 36 | M | 9 | 154 | 127 | 2 |
| 37 | F | 22 | 170 | 127 | 2 |
| 38 | F | 1 | – (*) | – | 2 |
| 39 | M | 1 | – | – | 2 |
| 40 | M | 1 | – | – | 2 |
| 41 | M | 22 | DND | DND | 2 |
Los resultados de electrolitos en sudor, se reportan en mmol/L, considerando un valor intermedio de <30 – 59 mmol/L y un valor alto >60mmol/L (Sosnay et al., 2017). (-): No realizado al momento del estudio. DND: Dato no disponible al momento del estudio. (*) paciente fallecida.
Extracción del ADN genómico
El ADN genómico fue extraído de los leucocitos y linfocitos de sangre periférica utilizando el estuche CASE Work IQ (Promega), siguiendo las instrucciones de la casa comercial.
Estudio genético :
Genotipificación del gen CFTR: En los 41 pacientes la detección de las mutaciones del gen CFTR fue llevada a cabo por secuenciación directa de los 27 exones del gen, utilizando los iniciadores diseñados y descritos por Zielenski et al.(Zielenski et al., 1991), siendo parte de una cohorte de pacientes con FQ, cuyos resultados genéticos fueron previamente analizados y publicados (Sánchez et al., 2016; Sánchez et al., 2014). Sin embargo, ya que estudian regiones intrónicas, ni el alelo poliT del intrón 8, ni se incluye el estudio de grandes deleciones y duplicaciones, los resultados obtenidos no excluyen la presencia de otras mutaciones en el gen CFTR.
Genotipificación de los genes TLR 5 y TLR 9: El polimorfismo (c.1174C>T; p.Arg392stop) (rs5744168) del gen TLR5 se determinó por secuenciación, utilizando los iniciadores TLR5-Fw: TTACAGACCTTGAGTCTCC y TLR5-Rv: CAGAATCTGGAGATGAGGTACCCG (Blohmke et al., 2010). El polimorfismo c.-1486T>C (rs187084) del gen TLR9, se determinó por secuenciación utilizando los iniciadores TLR9-Fw: ACTATGGAGCCTGCCTGCCATGATACC y TLR9-Rv: ATCCAGCCTTCTTACAAACCTCCCACCC (Berghöfer et al., 2005).
La secuenciación del gen CFTR y la determinación de las variantes de los genes TLR5 y TLR9 fue realizada con un secuenciador 3130xl (Applied Biosystems). La química utilizada fue BigDye Terminator 3.1. Los resultados obtenidos se analizaron con el programa Sequencing Analysis v5.3 y SeqScape v2.5 (Applied Biosystems).
Análisis Estadístico.
Las frecuencias genotípicas y alélicas fueron calculadas por contaje directo. Se realizó la prueba de equilibrio para determinar la distribución genotípica de los polimorfismos estudiados de acuerdo a Hardy-Weinberg (H-W).
RESULTADOS
Distribución de las frecuencias de las mutaciones del gen CFTR
La tabla 2 muestra la frecuencia genotípica de la evaluación genética, una vez examinados los 27 exones del gen CFTR por cada individuo (Sánchez et al., 2016; Sánchez et al., 2014). De los 41 pacientes incluidos, 29 pacientes (71%) presentaron dos alelos mutados causantes de FQ, 9 pacientes (22%) solo un alelo mutado y 3 pacientes (7%) ningún alelo mutado. Solo se consideraron mutaciones no sinónimas y sugestivas de ser causales de FQ. En total se detectaron 16 alelos, generando 16 genotipos diferentes, siendo el más frecuente el p.Phe508del/p.Phe508del (44%).
Tabla 2: Frecuencia genotípica de mutaciones en el gen CFTR en pacientes con FQ.
|
Genotipo Gen CFTR |
|||
| Alelo 1 | Alelo 2 | Frecuencia | Número de pacientes (n=41) |
| p.Phe508del | p.Phe508del | 43.9 | 18 |
| p.Phe508del | p.Asn1303Lys | 4.9 | 2 |
| p.Phe508del | p.Tyr109Cys | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | p.Trp277* | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | p.Arg334Trp | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | p.Ser549Arg | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | p.Arg553* | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | p.Leu558Ser | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | p.Arg1066Cys | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | p.Arg1158* | 2.4 | 1 |
| p.Gly542* | p.Glu1308* | 2.4 | 1 |
| p.Phe508del | – | 7.3 | 3 |
| p.Gly542* | – | 4.9 | 2 |
| p.Arg1162* | – | 4.9 | 2 |
| p.Asn900Lys | – | 2.4 | 1 |
| p.Tyr1015Cys | – | 2.4 | 1 |
| – | – | 7.3 | 3 |
La frecuencia está expresada en porcentaje. (-) No fueron detectadas mutaciones en las regiones evaluadas.
Distribución de la frecuencias alélicas y genotípicas del gen TLR5 y TLR9
El polimorfismo c.1174C>T del gen TLR5 está ausente en los individuos analizados. En contraste, se observó la presencia de los tres genotipos posibles para el polimorfismo c.-1486T>C del gen TLR9 (Tabla 3). Los resultados sugieren que la distribución de las frecuencias se ajustan al modelo del equilibrio de Hardy-Weinberg en la distribución de genotipos en pacientes (X2 = 2,03; p> 0,05).
Tabla 3: Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo c.-1486T>C del gen TLR9 en pacientes con FQ.
|
TLR9 c.-1486T>C |
Pacientes (n=41) |
|
Genotipos |
|
|
T/T |
29 (12) |
|
C/T |
56 (23) |
|
C/C |
15 (6) |
|
Alelos |
|
|
T |
57 (47) |
|
C |
43 (35) |
Los valores mostrados en paréntesis representan el número de individuos portadores del genotipo estudiado. La frecuencia está expresada en porcentaje.
En ningún caso fueron detectadas otras variantes dentro de las regiones secuenciadas.
DISCUSIÓN y CONCLUSIÓN:
La enfermedad pulmonar, asociada a la inflamación de las infecciones bacterianas y a la variabilidad fenotípica que se presenta en pacientes con FQ, dificulta el diagnóstico, pronóstico y el tratamiento de esta enfermedad. La correcta selección y estudio de polimorfismos en genes moduladores de la enfermedad, como los TLRs, constituyen piezas claves para proporcionar mayor entendimiento de la fisiopatología de la misma y potencialmente contribuir al desarrollo de tratamientos más individualizados.
En el presente estudio, se incluyeron, individuos tanto venezolanos de tercera generación como descendientes de poblaciones afroamericanas y caucásicas. Todos los pacientes presentan sintomatología clínica compatible con la enfermedad, en el 71% dos mutaciones causales de FQ fueron detectadas, en el 22% al menos una mutación causal fue detectada, considerado como un hallazgo confirmatorio y no excluyente en pacientes con clínica de FQ (De Boeck et al., 2006) y en el 7% de los pacientes ninguna mutación fue detectada. La ausencia de detección puede atribuirse a que, solo fueron sequenciados los exones del gen CFTR (no se incluyeron regiones intrónicas ni grandes deleciones y/o duplicaciones), aunado a que la población venezolana es altamente mestiza, dando lugar a la posibilidad de la existencia de nuevas variantes con efecto aún no estudiado, estos resultados concuerdan con los reportados para otros países de América latina (Pérez et al., 2007)
Considerando que la inhibición de TLR5 normaliza la respuesta inflamatoria generada por células epiteliales en las vías respiratorias de pacientes con FQ después de la exposición bacteriana (Blohmke et al., 2008) y debido a que hay evidencias de que las estrategias terapéuticas que inhiben la actividad del receptor TLR5 pueden ser beneficiosos para los pacientes con FQ (Blohmke et al., 2010), era de nuestro interés evaluar la presencia de este polimorfismo c.1174C>T del gen TLR5 en nuestra población, sin embargo, el alelo T no fue detectado, en contraste a lo descrito en poblaciones afroamericanas y europeas (0,06 y 0,07 respectivamente, NCBI: ss7988260). Sugerimos un estudio mas amplio para confirmar estos resultados.
En el gen TLR9, el alelo C del SNP c.-1486T>C está asociado con una menor expresión del receptor TLR9 (Elmaagacli et al., 2009; Tao et al., 2007). Este estudio permitió detectar la presencia individuos homocigotos para esta variante (CC: 15%), siendo la frecuencia de este alelo C en nuestra población de 0,43 y del alelo T de 0,57, similar a la descrita en poblaciones afroamericanas y europeas (0,625 y 0,659 respectivamente, NCBI: ss7987856 y ss68861046). Sugerimos esta variante como candidata para realizar un estudio más amplio y evaluar su posible asociación con sintomatología clínica en los pacientes estudiados. No se descarta también incluir la evaluación otros polimorfismos presentes en genes TLRs, así como en otros genes moduladores de la FQ.
Agradecimientos:
Agradecemos al personal médico del Programa Nacional de Fibrosis Quística, a los pacientes y familiares que colaboraron con este estudio.
