Rubén Megía González, Fran Garrigues

Hoy en día podríamos estar horas y horas hablando de las muchísimas técnicas que existen para secuenciar el ADN. Sin embargo, no siempre hemos tenido las herramientas de las que disponemos ahora para determinar la composición en bases de la molécula de la vida. Hoy, nos remontaremos a tiempos pasados, en los que solo unos pocos habían logrado desarrollar técnicas para la secuenciación del ADN, para hablaros de una de estas técnicas: la secuenciación de didesoxinucleótidos o secuenciación de Sanger.

El método de secuenciación de Sanger

El método de secuenciación de didesoxinucleótidos es una forma de secuenciar una secuencia de ADN relativamente sencilla. Se trata de una técnica desarrollada por el bioquímico británico Frederick Sanger a mediados del siglo XX. Si queréis conocer su historia, te invitamos a leer el post que le dedicamos a este gran investigador.

El método de secuenciación de Sanger se basa en la acción de las ADN polimerasas. Estas enzimas tan importantes para nuestras células son capaces de unirse a una cadena de ADN a la que se le haya unido un fragmento corto de ADN complementario (cebador) previamente e ir añadiendo nucleótidos. De este modo, a partir de una cadena simple, podemos obtener una doble cadena. Este proceso que ocurre de forma natural en nuestras células es el que ocurre también en la secuenciación de Sanger, salvo por un ingenioso detalle: la presencia de didesoxinucleótidos. Cuando una polimerasa inserta un didesoxinucleótido, la síntesis de la nueva cadena se detiene.

¿Qué se necesita para el método de Sanger?

Para secuenciar una molécula de ADN mediante el método de Sanger clásico, es necesario disponer de los siguientes elementos:

• ADN a secuenciar
• ADN polimerasa
• Primer o cebador (una secuencia de ADN que servirá como base para comenzar la síntesis de ADN)
• Nucleótidos (A, T, C y G). Uno de ellos, marcado radiactivamente.
• Didesoxinucleótidos (ddA, ddT, ddG y ddC), desoxirribonucleótidos con una pequeña modificación en el grupo unido al carbono 3 de la ribosa. Para que os hagáis una idea, os lo muestro en el siguiente esquema.

El método de Sanger original paso a paso

Una vez disponemos de los componentes necesarios, tendremos que seguir los siguientes pasos:

1. Amplificación del ADN

Lo primero que hay que hacer para secuenciar una molécula por el método de Sanger es amplificar el ADN que queremos estudiar. Esto servirá para obtener muchas copias del fragmento que queremos analizar.

Actualmente lo que se hace es amplificar el ADN mediante una PCR.

2. Preparación de la muestra

El segundo paso es añadir el ADN amplificado a las 4 reacciones independientes que se han de preparar, cada una de ellas con:

• Una ADN polimerasa
• Un primer específico
• Uno de los cuatro tipos de nucleótidos (A, C, T y G) marcado radiactivamente
• El resto de nucleótidos no marcados 
• En cada una de las disoluciones añadiremos una pequeña cantidad de un solo tipo de didesoxinucleótido.

3. Acción de la ADN polimerasa

El siguiente paso será propiciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN a partir de las dobles cadenas problema, amplificadas en pasos anteriores. Para ello, se aumenta la temperatura de las reacciones, lo que provoca la separación de las dos cadenas del ADN del que queremos conocer la secuencia. Luego dejaremos enfriar para favorecer la unión de los primers o cebadores.

Una vez unido el cebador, comenzará la reacción de la ADN polimerasa, que irá añadiendo nucleótidos marcados, hasta que inserte un didesoxinucleótido, se detenga la síntesis y la nueva cadena se suelte. Entonces, la ADN polimerasa empieza de nuevo. De este modo, en cada una de las reacciones obtendremos fragmentos de diferentes tamaños, acabados en el didesoxinucleótido que hayamos empleado en ellas.

4. Electroforesis

Tras la actuación de la ADN polimerasa, el resultado de cada una de las cuatro reacciones se somete a una electroforesis. Para los que no conozcáis esta técnica, una electroforesis consiste en colocar una mezcla de moléculas con diferente tamaño y/o carga eléctrica en un “filtro” o soporte poroso, que puede ser un papel, en un gel o en acetato de celulosa. Este filtro se introduce en una solución y se somete a un campo eléctrico. De este modo, las moléculas se moverán por bandas más o menos rápido por el filtro según su carga y tamaño. Por ejemplo, el ADN, que tiene carga negativa, migrará hacia el polo positivo.

Combinando la información de las cuatro electroforesis, podemos establecer  el orden de la cadena complementaria a la que estamos estudiando. Luego, solo hay que cambiar las bases por sus complementarias y ya tendríamos las dos. ¡Fantástico!

Secuenciación Sanger por electroforesis capilar

Sanger elaboró un método buenísimo y elegante para secuenciar el ADN de un organismo. Sin embargo, todavía tenía muchas cosas por pulir. Afortunadamente, las técnicas de electroforesis capilar y su automatización favorecieron modificaciones en el método de Sanger que perduran hasta el día de hoy: se dejó de utilizar nucleótidos radiactivos y se añadieron marcadores fluorescentes a los didesoxinucleótidos (cada uno de ellos de un color diferente). Desde luego, una técnica más visual y muchísimo más práctico, porque podemos visualizar los resultados en un único gel y con una sola reacción . De este modo, lo que antes veíamos como en la figura anterior, se puede ver como en esta figura. ¡Mucho más ordenado y vistoso!

Aplicaciones de la secuenciación de Sanger

La secuenciación de didesoxinucleótidos fue un bombazo científico en la década de los 70, que impulsó la creación de proyectos tan importantes como el Proyecto Genoma Humano, que empezaba a “cocinarse” como una posibilidad entre los científicos de todo el mundo. Después de unos años, en los años 90, comenzó formalmente este proyecto, gracias al avance en este tipo de técnicas de secuenciación y a la aparición de la PCR.

Actualmente la secuenciación de Sanger sigue utilizándose en los laboratorios, pero tiene sus limitaciones. Por ello, se han desarrollado diferentes técnicas de secuenciación de nueva generación, mucho más rápidas y económicas. Pero de esas hablaremos en otro post.

Hasta aquí el post de hoy. ¡Espero que hayáis aprendido un montón acerca de la secuenciación de Sanger! Si queréis saber más sobre este tipo de técnicas de secuenciación, no os podéis perder nuestro curso “Técnicas en Biología Molecular: claves para mejorar en el laboratorio”. En él, aprenderéis varias técnicas de análisis de ADN, ARN y proteínas de gran importancia en los laboratorios de biología molecular. ¡Nos leemos en el siguiente post!