Rubén Megía González
¡Hola GenoLovers! Hoy queremos hablaros de una de las técnicas de laboratorio más utilizadas en los laboratorios de biología molecular: la electroforesis. ¿Quieres saber en qué consiste esta técnica y qué aplicaciones tiene en el ámbito de la genética? ¡Pues sigue leyendo!
¿Qué es y cómo funciona?
La electroforesis es una técnica de laboratorio que se diseñó a principios de los años 30 y que sirve para separar moléculas en función de su tamaño y su carga. Esta técnica se basa en el diferente movimiento de las moléculas cargadas eléctricamente a través de la superficie hidratada de un medio sólido. Al hacer pasar una corriente sobre el medio, las moléculas con una carga negativa, se mueven hacia el ánodo (+), mientras que las moléculas con carga positiva, se ven atraídas hacia el cátodo (-).
La electroforesis sirve para separar las moléculas, además, en función de su tamaño. Esto es posible gracias a la utilización de un medio sólido poroso, como son los geles de poliacrilamida o los geles de agarosa. Para un mismo tamaño de poro, a mayor sea el tamaño de la molécula, más difícilmente migrará hacia el cátodo o el ánodo.
Tipos de electroforesis
Existen varios tipos de electroforesis, dependiendo del modo en el que se realicen.
Electroforesis en acetato de celulosa: se trata de un tipo de electroforesis en las que el soporte es un papel, que se coloca horizontalmente en un medio hidratado. Su utilización permite la separación de proteínas de una forma rápida.
Electroforesis en gel de agarosa: en este caso, se utiliza como soporte sólido un gel preparado con agarosa. Normalmente se utiliza para separar moléculas de gran tamaño, como ácidos nucleicos.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: en este tipo de electroforesis, se utiliza gel de poliacrilamida como soporte. Este gel es considerado como uno de los mejores soportes para electroforesis, pero tiene una desventaja: es neurotóxico, por lo que debe ser utilizado con precaución.
Electroforesis capilar: en la electroforesis capilar, el soporte es un fino tubo de sílica fundida. Al contrario que en el resto de tipos, la electroforesis capilar requiere de un dispositivo que permita detectar la migración de las moléculas en el soporte y que transmita los resultados a un ordenador. Esta técnica es bastante eficiente y requiere unos niveles menores de muestra y de reactivos que el resto de electroforesis.
Isoelectroenfoque: se trata de una técnica que separa las moléculas por la acción de un campo eléctrico y un gradiente de pH. Esta particularidad aumenta la resolución de la técnica, que permite separar mejor las moléculas.
Electroforesis bidimensional: es la combinación de una isoelectroenfoque y una electroforesis en gel de poliacrilamida. Permite separar mejor soluciones con una gran cantidad de proteínas diferentes.
Aplicaciones de la electroforesis en el ámbito de la genética
Si bien la electroforesis es capaz de separar diferentes moléculas, en el ámbito de la genética nos interesa su utilización principalmente en moléculas de ARN y ADN. En este contexto, la electroforesis puede ser una herramienta muy interesante de cara a diagnosticar diferentes enfermedades, entre otras muchas cosas.
Por ejemplo, en el caso de las enfermedades causadas por expansiones de trinucleótidos, podemos saber si una persona es susceptible a presentar dicha enfermedad en algún momento de su vida. Esto se hace comparando la migración del fragmento de ADN de la persona con un marcador de peso molecular estandarizado.
La electroforesis es una técnica interesante también en el ámbito de la Oncología. Y es que, durante el desarrollo del cáncer, pueden producirse fallos en la replicación del ADN, que lleven a la multiplicación de ciertos microsatélites únicamente en las células cancerosas. A este concepto se le conoce como “inestabilidad de microsatélites” y puede servir para monitorizar la progresión de un tumor.
Otro contexto en el que se utiliza la electroforesis es en los estudios de paternidad o en el ámbito de la genética forense. Aquí te ponemos un ejemplo en un caso práctico, al más puro estilo de Sherlock Holmes.
Existen otros ámbitos en los que la electroforesis puede ser de gran utilidad, como en estudios de poblaciones o en estudios filogenéticos.
Para que podáis comprender mejor cómo funciona la electroforesis de ADN, os vamos a mostrar un ejemplo práctico de cómo se utilizaría esta técnica para determinar las variantes de un gen que tiene una persona, en concreto, del gen PER3.
PER3 es un gen localizado en el cromosoma 1 humano, cuya función está relacionada con el ciclo circadiano. Algunas de las variaciones genéticas en este gen se han asociado al desarrollo de trastornos del sueño o enfermedades como el Alzhéimer o el cáncer. Más concretamente, en este ejemplo vamos a fijarnos en una región de este gen, que puede tener diferente número de copias de un microsatélite.
[accordion title=»Un ejemplo práctico: variantes en PER3″]
[accordion-item title=»Paso 1: extracción y preparación de la muestra de ADN»]
El primer paso en la realización de una electroforesis es obtener la muestra de ADN. En este caso, podríamos obtener la muestra de ADN de líneas celulares humanas o directamente de una muestra de sangre. En este ejemplo, obtendremos tres muestras problema, de tres líneas celulares humanas diferentes (de las que desconocemos qué variante de PER3 presentan). Una vez obtenidas las muestras de las tres líneas celulares es muy importante que purifiquemos el ADN, es decir, que separemos el ADN del resto de moléculas que no nos interesan.
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[accordion-item title=»Paso 2: Amplificación mediante PCR y tinción de la muestra»]
Ahora, es el momento de amplificar el fragmento que nos interesa mediante una PCR. Esto es importante porque, si hay poca muestra, no podremos observar correctamente los resultados de la electroforesis. Tras la PCR, tendremos miles de copias del gen PER3.
Una vez amplificadas las tres muestras problema, añadiremos a cada una el tampón de carga, una disolución que contiene dos componentes: glicerol, para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación en los pocillos del gel de electroforesis, y azul de bromofenol, para visualizar cómo avanza la electroforesis..
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[accordion-item title=»Paso 3: Electroforesis»]
En el siguiente paso, colocaremos el gel de agarosa, previamente preparado, en la cubeta de electroforesis y añadiremos un tampón que conserve el pH del medio y EDTA, para evitar que el ADN sea degradado.
Una vez hecho esto, colocaremos en los pocillos del gel de agarosa lo siguiente:
- En el primer pocillo, colocaremos un marcador de peso molecular, es decir, un “medidor” que nos ayudará a comparar mejor los resultados.
- En los pocillos 2, 3 y 4 colocaremos las muestras 1, 2 y 3 respectivamente
- En el pocillo 5 colocaremos un control positivo, una muestra que contiene el fragmento que nos interesa, para comprobar que sí se haya producido correctamente la PCR. En concreto, colocaremos una muestra con dos tipos de copias del gen PER3: PER34 y PER35 (cuya presencia vamos a valorar en nuestras muestras problema 1, 2 y 3).
- En el pocillo 6 colocaremos un control negativo, una muestra que contiene todos los reactivos utilizados en la PCR, pero no contiene ADN. Sirve para ver si alguno de los reactivos está contaminado.
Una vez hecho esto, cubrimos la cubeta con su tapa y conectamos la corriente eléctrica. Ahora, simplemente deberemos dejar pasar un tiempo para poder observar la migración de las moléculas de ADN sobre el gel de agarosa.
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[accordion-item title=»Paso 4: Análisis de resultados»]
Una vez detenida la electroforesis, obtendremos un resultado como el siguiente:
En nuestro caso, sabemos que el control contenía copias del gen PER3 con 4 copias del microsatélite (PER34) y con 5 copias del microsatélite (PER35). Por ese motivo, en la electroforesis del control positivo observamos dos bandas diferentes, con dos pesos moleculares diferentes:
- Una banda más cercana al ánodo (+), es decir, con un peso molecular menor. Esta corresponde a las copias PER34 .
- Una banda más cercana al cátodo (-), es decir, con un peso molecular mayor. Esta corresponde a las copias PER35.
Sabiendo esto y viendo los resultados de la electroforesis, ¿sabríais decirme el genotipo de cada una de las líneas celulares problema? ¡Os leemos en los comentarios!
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[accordion-item title=»Ejemplo práctico: Solución»]
Solución:
Muestra 1: se observa una única banda, que se encuentra a la misma altura a la banda de mayor peso molecular del control positivo. Por tanto, el genotipo es PER35/5
Muestra 2: se observan dos bandas, una correspondiente a la variante con 4 copias del microsatélite y otra correspondiente a la variantes con 5 copias del microsatélite. El genotipo es PER34/5
Muestra 3: se observa una única banda, que se encuentra a la misma altura a la banda de menor peso molecular del control positivo. El genotipo, por tanto, es PER34/4
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Y bien, hasta aquí el post de hoy. Si queréis conocer consejos acerca de esta y otras técnicas que se utilizan diariamente en los laboratorios de biología molecular, no os podéis perder nuestro curso “Técnicas en Biología Molecular: claves para mejorar en el laboratorio”. ¡Nos leemos en el próximo post!
Enlaces de interés:
Archer SN, Schmidt C, Vandewalle G, Dijk DJ. Phenotyping of PER3 variants reveals widespread effects on circadian preference, sleep regulation, and health.2018. Sleep Med Rev. 40:109-126. doi: 10.1016/j.smrv.2017.10.008.
