NGS: Secuenciación de Segunda Generación

Fran Garrigues

Hola chic@s,

Como ya os avancé en mi anterior post de Secuenciación Sanger, el tema de este nuevo post sería la SECUENCIACIÓN DE SEGUNDA GENERACIÓN o NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS). Y lo prometido es deuda.

El concepto de NGS sirve para englobar todas las tecnologías destinadas a llevar a cabo la secuenciación masiva a gran escala de cualquier ácido nucleico en la actualidad.

NGS
El concepto de NGS sirve para englobar todas las tecnologías destinadas a llevar a cabo la secuenciación masiva a gran escala de cualquier ácido nucleico en la actualidad.

Desde que el Proyecto Genoma Humano se completó hace más de una década, numerosos científicos han tratado de diseñar nuevas estrategias, con menor tasa de error y de una forma más rápida y barata, para llevar a cabo la secuenciación masiva de los ácidos nucleicos. La comercialización de las primeras tecnologías NGS, en 2005, supuso una revolución en el ámbito de la investigación de genómica básica y aplicada. Todo ello, gracias a la capacidad de generar una mayor cantidad de lecturas del genoma que permitieran obtener un resultado más sólido, a precios más asequibles y en un menor período de tiempo. Además, este avance permitió incorporar el análisis en paralelo de multitud de secuencias a la vez en plataformas manejables, por lo que estos métodos de secuenciación también reciben el nombre de High-throughput DNA sequencing o “Massively Paralllel Sequencing.

No obstante, para conseguir estos logros, fue inevitable reducir el tamaño de lectura, hecho que dificultará el posterior análisis bioinformático. El tamaño de lectura es muy importante a la hora de secuenciar, porque cuanto mayor sea la longitud de la secuencia, el fragmento del genoma cubierto es también más grande, por lo que, en el posterior análisis bioinformático, hay un menor número de lecturas que solapar. En cambio, si las lecturas son más cortas, el fragmento del genoma cubierto es más pequeño, y con ello el número de lecturas finales para tratar de cubrir el genoma completo será mucho mayor, hecho que dificultará el ensamblaje en el posterior análisis.

NGS
El tamaño de lectura es muy importante a la hora de secuenciar, porque cuanto mayor sea la longitud de la secuencia, el fragmento del genoma cubierto es también más grande, por lo que, en el posterior análisis bioinformático, hay un menor número de lecturas que solapar (A). En cambio, si las lecturas son más cortas, el fragmento del genoma cubierto es más pequeño, y con ello el número de lecturas finales para tratar de cubrir el genoma completo será mucho mayor, hecho que dificultará el ensamblaje en el posterior análisis (B).

Las plataformas de secuenciación NGS son múltiples y variadas, cada una con sus respetivas particularidades, pero todas ellas tienen en común que la detección del ácido nucleico no es aplicable a una única molécula, por lo que se requiere de una previa amplificación del fragmento a secuenciar para poder obtener lecturas secuenciadas del mismo. Este proceso puede darse o bien mediante una PCR en emulsión o una PCR puente. En el primer caso, la mezcla de reacción consiste en una emulsión aceite-agua creada para encapsular complejos entre el ADN y nanoesferas, dentro de gotículas de agua. Tras la emulsión, se lleva a cabo la amplificación, de tal manera que cada nanoesfera queda recubierta por varios miles de copias de la misma secuencia molde formando una polonia (nombre que recibe el conjunto de copias de la misma secuencia).  Dependiendo de la plataforma NGS, estas nanoesferas se unen químicamente a la superficie de cristal (SOLID) o se depositan en los pocillos de las placas multipocillo empleadas en dicha plataforma (454 Life Sciences y Ion Torrent). En el segundo caso, la secuenciación tiene lugar sobre una placa de vidrio, sobre la que están dispuestos adaptadores complementarios a los adaptadores anclados en las secuencias desnaturalizadas a secuenciar. Así, cada fragmento de ADN monocatenario se unirá por uno de sus extremos a uno de los oligonucleótidos complementarios presentes en la placa. Tras la acción de la polimerasa, que utiliza estos adaptadores como cebador, se sintetiza la cadena complementaria, quedando inmovilizada. Seguidamente, tendrá un nuevo ciclo de desnaturalización, provocando que las hebras desnaturalizadas formen puentes gracias a la unión de su extremo libre con otro de los adaptadores inmovilizados en la placa. Este proceso se repite varias veces, hasta formar lo que se conoce como clusters, una agrupación de secuencias idénticas inmovilizadas sobre una superficie sólida. Este mecanismo es propio de Illumina.

NGS
En la PCR en emulsión (A), la mezcla de reacción consiste en una emulsión aceite-agua creada para encapsular complejos entre el ADN y nanoesferas, dentro de gotículas de agua. Tras la emulsión, se lleva a cabo la amplificación, de tal manera que cada nanoesfera queda recubierta por varios miles de copias de la misma secuencia molde formando una polonia. En la PCR puente (B), la secuenciación tiene lugar sobre una placa de vidrio, sobre la que están dispuestos adaptadores complementarios a los adaptadores anclados en las secuencias desnaturalizadas a secuenciar. Así, cada fragmento de ADN monocatenario se unirá por uno de sus extremos a uno de los oligonucleótidos complementarios presentes en la placa. Tras la acción de la polimerasa, que utiliza estos adaptadores como cebador, se sintetiza la cadena complementaria, quedando inmovilizada. Seguidamente, tendrá un nuevo ciclo de desnaturalización, provocando que las hebras desnaturalizadas formen puentes gracias a la unión de su extremo libre con otro de los adaptadores inmovilizados en la placa. Este proceso se repite varias veces, hasta formar lo que se conoce como clusters, una agrupación de secuencias idénticas inmovilizadas sobre una superficie sólida.

El inconveniente que supone la introducción de esta etapa, es la posible incorporación de errores debidos a fallos en la polimerasa durante el proceso de síntesis de nuevas copias mediante PCR.

A continuación, os voy hacer una breve presentación, ordenadas de más anticuadas a más utilizadas, de las plataformas más comunes disponibles en la actualidad.

454 Life Sciencies

La tecnología 454 es la tecnología de secuenciación masiva comercializada por la compañía Roche. Esta estrategia se fundamenta en la pirosecuenciación, una metodología que se basa en la detección quimioluminiscente del pirofosfato liberado durante la elongación de la cadena complementaria de ADN, lo que permite la rápida determinación de secuencias a tiempo real. A pesar de que el coste por carrera es relativamente caro, es una tecnología capaz de ofrecer lecturas largas, de alrededor de 700 pares de bases (pb), en un período de tiempo más o menos corto. Sin embargo, es poco sensible, en la detección de homopolímeros. A día de hoy, 454 es una plataforma prácticamente en desuso, ya que el resto de tecnologías disponibles ofrecen resultados de mejor calidad y a un mejor precio.

SOLID (Support Oligonucleotide Ligation Direction)

SOLID es la única estrategia que lleva a cabo una secuenciación por ligación. Tras su salida al mercado, captó la mirada de muchos investigadores, pero su alta tasa de error y la generación de secuencias muy cortas, de unas 50 pb, provocó que, con el paso de los años, como en el caso de 454, sea una de las estrategias menos utilizadas.

Ion Torrent Sequencing

Ion Torrent Sequencing es una estrategia basada en el método de secuenciación mediante un ion semiconductor, de forma, que cada vez que se incorpora un nuevo nucleótido a la cadena, en síntesis, se libera un protón (H+), que modifica el pH, detectando la incorporación del mismo. Para discernir cuál de los nucleótidos se ha introducido, se repiten varios ciclos, cada uno de ellos, con la adición de un único nucleótido.

Aunque esta plataforma no está destinada para la secuenciación de genomas completos, debido a que el resultado obtenido a esta escala no es el más aconsejable, es altamente competitivo en cuanto a precio, rapidez y calidad para paneles de genes pequeños y el análisis de exomas. Además, por sus características de trabajo, es ideal para los laboratorios de diagnóstico, ajustados a tiempos muy precisos.

Illumina

Illumina es la tecnología de secuenciación más utilizada hoy en día debido a que ofrece plataformas efectivas (MiniSeq o HiSeq XTen, entre otras) capaces de ofrecer resultados competentes a precios razonables. Esta metodología se caracteriza por el uso de nucleótidos marcados con fluoróforos que bloquean de forma reversible la elongación de la cadena. De este modo, tras la detección de la incorporación del fluoróforo, y la eliminación del mismo, es posible continuar con un nuevo ciclo de adición de un nuevo nucleótido. Es lo que se conoce como secuenciación por síntesis. Illumina ha permitido abaratar los costes y ofrecer lecturas más largas, sin embargo, se requiere de una gran inversión inicial y de mantenimiento, para poder adquirir y mantener uno de los equipos que ofrece.

Como se puede observar, cada una de las diferentes plataformas descritas tienen sus propias ventajas y desventajas. Por ello, actualmente, elegir la plataforma NGS que mejor se adecúe a la necesidad del proyecto u actividad a desempeñar es una decisión crítica para los científicos y laboratorios.

NGS
Actualmente, elegir la plataforma NGS que mejor se adecúe a la necesidad del proyecto u actividad a desempeñar es una decisión crítica para los científicos y laboratorios.

Espero que os haya gustado, nos vemos pronto medigenétic@s 🙂

CURSOS RELACIONADOS
CON ESTE ARTÍCULO

6 comentarios de “NGS: Secuenciación de Segunda Generación

  1. Maria dice:

    Hola!

    Tengo que hacer el proyecto de fin de grado sobre NGS y estoy un poco perdida, he leído esta página y esta muy bien. Gracias!!
    Si tienes más información sobre ello me podrías mandar o publicar por favor, sería de gran ayuda, ya que no encuentro las aplicaciones que tiene en diferentes citologías, un protocolo, los diferentes aparatos hay(Ion Torrent y si hay alguno mas) costes, duración, otras alternativas…
    Muchas gracias!

    • Genotipia dice:

      Hola Ferrán:

      No entendemos muy bien tu pregunta.
      ¿Te refieres a qué precio tendría una prueba para detectar el virus con 100% de efectividad? Depende de muchos factores. Por ejemplo, no es lo mismo la detección en un laboratorio de investigación que puede realizar diferentes pruebas de confirmación que una prueba que requiere hacerse de forma masiva y optimizar factores de diseño y recursos.

      ¡Un saludo!

Deja una respuesta

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *

🕒 ÚLTIMAS 48 HORAS | 65% DTO en todos los cursos 
Ver cursos
close-image

Crea tu cuenta de Genotipia

Regístrate ahora y accede a la primera comunidad especializada en genética médica y genómica.

Los usuarios registrados de Genotipia disfrutan de:

  • Acceso a la comunidad de profesionales y a tu perfil
  • Acceso a los foros de la comunidad: noticias del día, bolsas de empleo, etc
  • Descuentos en nuestros cursos especializados
  • Acceso prioritario a jornadas y sorteos de Genotipia
  • Suscripción quincenal a Genética Médica News
  • Suscripción anual a nuestra revista científica: Genética Médica y Genómica
  • Este campo es un campo de validación y debe quedar sin cambios.