INTRODUCCIÓN

La acidosis tubular renal distal (ATRD) es una tubulopatía, o enfermedad del túbulo distal del glomérulo renal, caracterizada por presentar una acidosis metabólica en sangre con orina alcalina, además de hipercalciuria e hipopotasemia. Ésta puede ser esporádica o hereditaria, con un patrón de herencia autosómica dominante o recesiva (Escobar et al., 2013). La presentación clínica es variable, desde una acidosis leve compensada y con algún cálculo renal incidental, hasta una acidosis grave descompensada, con retraso en el crecimiento y nefrocalcinosis causante de insuficiencia renal.

Como norma general, los pacientes con ATRD de herencia dominante tienen un fenotipo más leve que aquéllos con herencia recesiva. Existe un subgrupo de pacientes con ATRD con herencia recesiva que padece sordera neurosensorial progresiva, causada por mutaciones en el gen que codifica la subunidad B1 de la H-ATPasa (ATP6V1B1) (López Hidalgo et al., 2009).

La clínica de esta alteración tubular, además de la sordera, es similar a la descrita en otros tipos de ATRD, pero con una sordera neurosensorial progresiva. La paciente que presentamos en este trabajo sufría de acidosis metabólica con historia de vómitos, dolor osteomuscular y, últimamente, dificultades para caminar. Sólo requiere de tratamiento sintomático y seguimiento por el nefrólogo.

En la tabla 1 se describen los principales tipos de acidosis tubular renal aunque, en los últimos años, se han asociado también a la ATRD las alteraciones en los genes FOXI1 y WDR72.

TIPOS DE ATRD	GEN	HERENCIA	ASOCIACIÓN
ATRD TIPO 1	SLC4A1	AD	Nefrocalcinosis
ATRD TIPO 2	ATP6V1B1	AR	Sordera neurosensorial
ATRD TIPO 3	ATP6V0A4	AR	Con o sin sordera
ATRD TIPO 4	SLC4A1	AR	Anemia hemolítica

Tabla 1. Tipos de acidosis tubular renal.

 

La H-ATPasa vacuolar (V-ATPasa) es un componente imprescindible en todos los organismos eucariotas superiores. Incluida en una familia de bomba de hidrogeniones está presente en cantidad de membranas de muchos orgánulos, donde crea un bajo pH intravacuolar y permite las funciones fisiológicas adecuadas de dichas membranas.

La V-ATPasa es una enzima multimérica y compleja que consta de múltiples subunidades y dos dominios: uno en la membrana (V0), implicado en el transporte de los iones H+, y otro, catalítico, en el citosol (V1). De las 14 subunidades que componen la enzima, 8 subunidades (denominadas de la A a la H) forman parte del dominio V1 y 6 subunidades (a, c, c», d, e, y Ac45 en mamíferos) forman el dominio V0 . En el dominio catalítico existen 3 copias de las subunidades A y B organizadas de forma intercalada en una estructura en forma de anillo. Los sitios catalíticos se encuentran en la subunidad A1, y la regulación de la enzima está mediada por la interfase entre A y B (Montes et al, 2002).

Las subunidades B1 y a4 son específicas de riñón, de las células intercaladas alfa del túbulo colector. En estas células, la V-ATPasa se localiza en las membranas apicales y secreta iones H+ en la orina, de forma que alteraciones en B1 o a4 contribuyen a la acidificación de la orina (Escobar et al., 2013). Además, la subunidad B1 también se expresa en el oído, en las células ciliares. Por tanto, mutaciones patogénicas en la subunidad B1, afectan tanto al túbulo renal como al oído interno. Esta subunidad B1 de la V-ATPasa, que consta de 513 aminoácidos, está codificada por el gen ATP6V1B1. (Karen et al., 1999).

 

CASO CLÍNICO

Mujer de 60 años de edad, sorda desde hace 50 años, con historia de acidosis tubular renal desde su infancia, en quien se ha documentado proteinuria y nefrolitasis mediante la historia clínica, sin antecedentes de consanguineidad, ni datos de enfermedades congénitas. Refiere dos hermanos sanos (no tiene hijos).

En la actualidad está en seguimiento por nuestro servicio hospitalario de Nefrología por datos de enfermedad renal y proteinuria estable sin albuminuria, no anemia. A la ecografía renal se objetivan ambos riñones de unos 10 y 11 centímetros de tamaño, con hiperecogenicidad difusa de las pirámides de forma bilateral en relación con nefrocalcinosis medular. No se evidencian lesiones nodulares ni dilatación de la via excretora. Vejiga correctamente repleccionada, sin lesiones parietales excrecentes. Resto del estudio sin hallazgos.

Tras 50 años de seguimiento y control se decide solicitar un estudio genético indeterminado, a nuestra sección de Genética Clínica. Recibimos 10 mL de sangre total con EDTA y, en base a los antecedentes de acidosis tubular distal, nefrocalcinosis e hipoacusia, se decide realizar un exoma clínico, dirigido a estas patologías, en un laboratorio externo.

Metodología

Muestra. Extracción de ADN a partir de Sangre periférica.

Extracción de ADN. La extracción de ADN genómimco (ADNg) se realizó empleando el equipo Magna Pure 24 siguiendo las especificaciones del fabricante.

Valoración de la calidad y cantidad de ADNg extraído. Para el cálculo de la cantidad de ADNg extraído se empleó un fluorímetro (Quibit 3.0). Se estudió también las relaciones de absorbancias a 260/280 y 260/230 para determinar la calidad del ADN obtenido, usando un equipo NanoDrop ND-2000. Además, el ADN genómico extraído se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% siendo revisadas visualmente en el transiluminador.

Secuenciación de exoma clínico. Para la secuenciación del exoma clínico se ha utilizado un método de enriquecimiento mediante captura con sondas específicas (SeqCap EZ) y posterior secuenciación masiva de doble lectura en un equipo DNBseq-G400.

Priorización de genes en base a un panel de Hipoacusia & Nefropatías. El resultado de esta priorización es un conjunto de 389 genes (HPO, Human Phenotype Ontology ).

Algoritmo bioinformátco. El análisis de las secuencias obtenidas se ha realizado con el software GenoSystem Variant AnalysisTM. Este software contiene un algoritmo optimizado que incluye (entre otros pasos), lo siguiente:

• Control inicial de calidad de las secuencias.
• Filtrado de las secuencias mediante eliminación de indeterminaciones, adaptadores y zonas de baja calidad.
• Segundo control de calidad de las secuencias.
• Mapeo sobre el genoma de referencia Hg19.
• Obtención de variantes y CNVs.
• Estudio de cobertura del mapeo.
• Anotación de variantes. Este software está dirigido a la identificación de variantes localizadas en regiones exónicas y de splicing (+/- 10pb) que se encuentren en una frecuencia alélica >30% de las lecturas. El estudio de CNVs se ha llevado a cabo utilizando el software Exomedepth.
• Confirmación de variantes. Las variantes puntuales y pequeñas inserciones/deleciones (Indel) clasificadas como patogénicas o probablemente patogénicas que, bajo los criterios de calidad establecidos previamente, se consideren candidatas de validación, serán confirmadas mediante secuenciación Sanger bidireccional, así como las deleciones o duplicaciones serán confirmadas mediante MLPA (siempre que existan sondas disponibles en MRC Holland).
• Bases de datos consultadas para la anotación de las variantes: BIC, LOVD, InSiGHT, ClinVar, UMD, ExAc, Bases de datos de genes específicos, entre otras.
• Criterios de clasificación de las variantes: Para ayudar en el proceso de interpretación de variantes se siguen los criterios de evaluación recomendados por la American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) (Richards et al., 2015).
• En el caso de variantes de significado incierto no descritas se emplean programas de predicción in silico de las UVS; SIFT, Polyphen2, MutatonTaster y Provean. Para la predicción de variantes de splicing se emplea el programa Human Splicing Finder.

Las variantes que se incluyen, en el informe realizado, son:

• Variantes descritas como patogénicas o probablemente patogénicas en la literatura y bases de datos.
• Variantes con MAF <0,1% en genes con herencia autosómica dominante que pudiesen sugerir una correlación genotipo-fenotipo.
• Variantes con MAF <1 % en homocigosis o heterocigosis compuesta en genes con herencia autosómica recesiva que pudieran sugerir una correlación genotipo-fenotipo. Por tanto, una sola variante en genes con herencia autosómica recesiva no será informada.

• Variantes en genes con herencia ligada al cromosoma X, hemicigotas en el paciente, que estén descritas en bases de datos poblacionales (GnomAD y base de datos propia) en menos de 20 casos en mujeres con posible relación con el fenotipo del paciente.
• No se incluyen variantes consideradas benignas o probablemente benignas según la literatura y bases de datos actuales. Tampoco se incluyen en este informe las variantes en genes asociados previamente a patologías que no explican el fenotipo del paciente.

En genética, la frecuencia del alelo menos común, abreviada MAF (en inglés: minor allele frequency), se define como la frecuencia del alelo menos común en un determinado locus, dentro de una población.

El panel utilizado incluye 389 genes y su cobertura (número de lecturas igual o superior a 15x) es 99.9%. Por tanto, podrían existir algunas regiones no cubiertas en las cuales no sería posible detectar variantes. Este estudio no incluye variantes en las regiones intrónicas y ADN mitocondrial. Existen algunos tipos de variantes que por su naturaleza puede que no sea posible su detección o que no se detecten con la máxima exactitud utilizando la técnica empleada:

• La tecnología NGS no detecta cambios en regiones repetitivas de trinucleótidos, cambios epigenéticos o INDELs que por su tamaño y/o estructura limiten su captura y alineamiento.
• Las regiones que presenten una alta homología de secuencia como genes homólogos o pseudogenes, etc. son complicadas de secuenciar y podrían dar lugar a falsos positivos y/o negativos.
• Esta tecnología no permite detectar translocaciones ni reordenamientos balanceados.
• Las regiones homopoliméricas de más de 6-7 nucleótidos no pueden ser secuenciadas con precisión.
• En caso de mosaicismos, éstos pueden no ser detectados si la frecuencia de la variante es menor al 30% de las lecturas.

Resultados

En nuestro caso clínico presentamos dos mutaciones, en heterocigosis compuesta, en el gen ATP6V1B1.

En primer lugar (Tabla 2) se detectó la variante c.585+1G>A clasificada como Patogénica, en heterocigosis, en este gen. Este cambio de secuencia afecta a un sito de empalme donante en el intrón 6 del gen ATP6V1B1. Se espera que interrumpa el empalme del ARN. Las variantes que interrumpen el sitio de empalme del donante o del aceptor generalmente conducen a una pérdida de la función de la proteína (PMID: 16199547), y se sabe que las variantes de pérdida de función en ATP6V1B1 son patogénicas (PMID: 9916796, 18368028). Los datos de frecuencia para esta variante en las bases de datos de población se consideran poco confiables, ya que las métricas indican una mala calidad de los datos en esta posición en la base de datos de gnomAD. Se ha observado la interrupción de este sito de empalme en individuos con acidosis tubular renal con sordera neurosensorial (PMID: 9916796). ClinVar contiene una entrada para esta variante (ID de variación: 12227). Los algoritmos desarrollados para predecir el efecto de los cambios de secuencia en el empalme del ARN sugieren que esta variante puede alterar el sito de empalme de consenso.

En resumen, la evidencia actualmente disponible indica que la variante es deletérea. Por lo tanto, esta variante fue clasificada como Patogénica.

 

Gen	Variante (c.DNA, Prot)	Tipo de    variante	Estado	Herencia	Procedencia	Interpretación	Criterios  (ACMG)
ATP6V1B1  (NM_001692.3)	c.585+1G>A	Splicing	HET	Autosómica Recesiva	Por                     determinar	Patogénica	PVS1,PM2,PP5
Exón	Coordenada (hg19)	Frec               GnomaD	Frec. Geno	Predictores	Cobert. Gen	Prof.	Zigosidad
Exon 6 de 13	chr2:71187209	0.000 %	0.00 %	-|P|-|-	100.0	146x	49.32% HET
OMIM:267300	Acidosis tubular renal distal tipo 2, con sordera nerviosa progresiva
Clinvar: 27266	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/12227/?oq=27266[alleleid]&m=NM_001692.4(ATP6V1B1):c.585%201G%3EA

Tabla 2.  Variante patogénica del gen ATP6V1B1

 

En último lugar (Tabla 3) se detectó la variante c.551C>G (p.Pro184Arg) clasificada como de Significado Incierto (VUS), en heterocigosis, en el gen ATP6V1B1. Esta variante c.551C>G (p.Pro184Arg), detectada en heterocigosis en el exón 6 del gen ATP6V1B1, provoca el cambio de una Citosina (C) por Guanina (G) en la posición nucleotídica 551 del c.DNA (NM_001692.3). La consecuencia proteica de esta variante implica un cambio en la secuencia aminoacídica de una Prolina (Pro) por una Arginina (Arg) en la posición 184 (P184R). El residuo de Prolina está muy conservado y existe una diferencia fisicoquímica moderada entre ambos aminoácidos. Esta variante no se ha reportado hasta el momento en base de datos de población control (GnomAD – sin frecuencia). No se ha reportado hasta el momento en base de datos ClinVar. Esta variante, hasta donde sabemos, no se ha publicado en la bibliografía científica. Los algoritmos desarrollados para predecir el efecto de los cambios de sentido erróneo en la estructura y función de las proteínas indican que este cambio no es tolerado, sin embargo, estas predicciones no han sido confirmadas por estudios funcionales publicados

En base a los criterios descritos, se clasifica esta alteración (P184R) como una variante de Significado Incierto (VUS).

 

Gen	Variante (c.DNA, Prot)	Tipo de  variante	Estado	Herencia	Procedencia	Interpretación	Criterios  (ACMG)
ATP6V1B1 (NM_001692.3)	c.551C>G p.Pro184Arg	Missense	HET	Autosómica Recesiva	Por                       determinar	Significado               incierto	PM2,PP3
Exón	Coordenada (hg19)	Frec                GnomaD	Frec. Geno	Predictores	Cobert. Gen	Prof.	Zigosidad
Exon 6 de 14	chr2:71187174	0.000 %	0.00 %	-,P|P|-,P|-,P	100.0	246x	54,88% HET
OMIM:267300	Acidosis tubular renal distal tipo 2, con sordera nerviosa progresiva

Tabla 3.  Variante de significado incierto en el gen ATP6V1B1.

 

Ambas variantes se presentan en dos alelos diferentes, explicitado mediante Integrative Genomics Viewer (Imagen 1). El visor integrador de genómica (IGV) es una herramienta interactiva de alto rendimiento y fácil de usar para la exploración visual de datos genómicos.

 

DISCUSIÓN

El hecho de que la herencia de la ATD tipo 2 sea autosómica recesiva, y de que sólo hayamos detectado una variante patogénica, haría que descartáramos el origen hereditario del cuadro de nuestra paciente, pero no debemos hacerlo de manera absoluta. ¿Por qué?

El cuadro clínico de nuestra paciente, tubulopatía renal y sordera neurosensorial, se correlaciona con el cuadro que provoca las variantes patogénicas del gen ATP6V1B1 (Kliegman et al., 2020), es decir, la acidosis tubular renal distal con hipoacusia neurosensorial progresiva (OMIM #267300). La acidosis metabólica, la hiperémesis, la hipopotasemia, junto con nefrolitiasis y proteinuria se correlaciona con el cuadro clínico descrito.

Además, la disposición en trans de ambas variantes (cada variante en un alelo diferente), hablaría en favor del posible origen de estas variantes en la enfermedad de nuestra paciente.

Es decir, no podemos descartar la variante de significado incierto de nuestro gen ATP6V1B1 (P184R) como causal de la tubulopatía de nuestra paciente sordomuda. Por tanto, el asesoramiento genético que recibió pasó por la recomendación del estudio de ambas variantes en los familiares directos de nuestra paciente, al considerarlas como posiblemente causantes del cuadro clínico.

 

CONCLUSIÓN

 La variante missense c.551C>G (p.Pro184Arg), clasificada como de Significado Incierto en el gen ATP6V1B1, se ha comportado realmente como deletérea por lo que la consideramos como una variante informativa.

 

Declaración de conflictos de interés

El autor primer firmante del manuscrito de referencia, en su nombre y en el de todos los autores firmantes, declara que no existe ningún potencial conflicto de interés relacionado con el artículo.