Amparo Tolosa, Genotipia
Como responsable del Servicio de Genómica y Secuenciación Masiva del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Fernando Carrasco está al día de las últimas tecnologías de secuenciación de ADN o ARN y conoce su utilidad en la investigación básica y aplicada.
Fernando Carrasco (Madrid, 1976) es experto en el diseño experimental de proyectos de secuenciación masiva. Para Carrasco, las tecnologías de secuenciación masiva son impresionantes obras de ingeniería y conocimiento bioquímico. Especialmente, aquellas que utilizan conceptos sencillos para obtener algo tan complejo como las instrucciones de un ser vivo. Conocedor de las ventajas y limitaciones de cada aproximación, Carrasco sabe cómo seleccionar la tecnología que más se adapta a las necesidades de un investigador y cuáles son las principales dificultades a la hora de interpretar los datos para obtener la ansiada respuesta a una cuestión biológica.
¿Qué término deberíamos utilizar? ¿NGS, secuenciación masiva, MPS?
En primer lugar, si hablamos en castellano yo soy partidario de usar el término castellano. Y dentro de esto prefiero usar el término ‘secuenciación masiva’ o ‘secuenciación masiva paralelizada’, que es MPS. Da una idea de en qué consiste la tecnología y no está sujeto como ‘NGS’ o ‘secuenciación de nueva generación’ a las sucesivas generaciones de tecnologías que se van generando. De hecho, ya hay quien habla de next-next-generation.
¿Cuánto tiempo llevas trabajando en secuenciación de genomas?
En secuenciación masiva, desde el 2008.
¿Cuáles son los avances que más te han impactado?
La verdad es que, en general, todas las tecnologías son impresionantes, porque detrás de todas ellas hay gente muy inteligente. Me sorprende mucho la miniaturización de las cosas, que tiene mucho que ver con ingenieros y nanotecnológos, así como el nivel de conocimiento a nivel enzimático que tienen las personas que inventan estas cosas. La tecnología de Illumina, por ejemplo, reúne casi todas las ventajas, menos las lecturas largas. Además, desde el punto de vista conceptual, me gusta mucho la idea de Thermo Fisher porque es un pH-metro avanzado, un equipo que secuencia a base de medir protones que se desprenden cuando se incorpora un nucleótido convencional, no marcado. Me parece una idea brillante. También la idea de Oxford Nanopore Technologies de utilizar una corriente eléctrica que se interrumpe al hacer pasar una molécula a través de un agujero. Las ideas que más me gustan son las que son muy fáciles de entender. Que algo tan sencillo permita lograr algo tan complejo me parece increíble, aunque ahora mismo la de Oxford Nanopore Technologies sea de las tecnologías que más inmaduras están.
Precisamente Oxford Nanopore Technologies destacó hace unos años al crear un secuenciador de bolsillo. ¿Has tenido oportunidad de probarlo? ¿Cuáles fueron tus impresiones?
Participamos en un programa de acceso temprano a MinION en la prueba de algunos usuarios del centro. Tuvimos resultados dispares pero, en aquel momento, lo que buscaba la empresa era un desarrollo de la tecnología en comunidad. Esta idea era diferente. En lugar de desarrollar su tecnología de puertas hacia adentro, lo que hicieron en Oxford Nanopore Technologies fue intentar crear una comunidad de usuarios y desarrollar junto a ellos la tecnología. La sensación que tuvimos fue que era una tecnología muy interesante pero que requería que el usuario estuviera muy pendiente y en contacto constante con la compañía, que por aquel entonces no tenía representación en España. El sistema ha ido evolucionando y Oxford Nanopore Technologies ahora dispone también de un equipo mediano y uno más grande.
¿Qué tipos de aplicaciones permiten hoy en día las diferentes plataformas de secuenciación?
Muchísimas. Se puede hacer ensamblaje de novo de genomas, resecuenciación para buscar variantes de interés clínico o biotecnológico, secuenciación de cromatina inmunoprecipitada para estudiar las secuencias a las que se une una proteína de interés, metagenómica para analizar la diversidad biológica en una muestra, tanto con ADN como con ARN, transcriptómica para ver expresión…
Desde el Servicio de Genómica y Secuenciación Masiva del CBMSO ofrecéis asesoramiento y asistencia en estas tecnologías de análisis del ADN o ARN ¿Cuál es vuestro protocolo cuando llega un investigador y os dice “tengo un proyecto y quiero secuenciar”?
En proyectos que requieren secuenciación masiva el flujo de trabajo tiene cuatro pasos. El primero es el diseño experimental, en el que nosotros preguntamos al investigador cuáles son sus preguntas biológicas. Una vez que sabemos qué quiere saber, hacemos un diseño experimental que incluye cosas como seleccionar la tecnología que resulta más adecuada desde el punto de vista técnico y económico. También decidimos qué tipo de lecturas vamos a hacer, si más largas o más cortas, con qué profundidad… Después viene el paso de preparación de librerías que es preparar la muestra para que se pueda secuenciar. El tercer paso es la secuenciación masiva propiamente dicha. Y el cuarto paso es el análisis computacional de los datos, que suele ser el cuello de botella porque es muy especializado.
Nosotros los pasos dos y tres los externalizamos a una serie de proveedores externos que conocemos y con los que trabajamos. Lo hacemos así porque nosotros no tenemos equipos, lo que fue una decisión del centro. Se trata de sistemas que requieren gran inversión inicial y gran mantenimiento anual. Además, como son equipos de alta capacidad, para darles un uso elevado necesitas muchos proyectos. Por todo esto no les hubiéramos sacado tanto partido. Otra de las razones es que nosotros no utilizamos siempre el mismo secuenciador o la misma tecnología y tener un equipo de cada tipo lo haría más caro a nivel de centro.
Con el tiempo hemos ido seleccionando cuidadosamente una serie de proveedores, principalmente españoles y públicos, aunque también tenemos otros en el resto de Europa. Tenemos usuarios de todo tipo, virus bacterias, parásitos, cáncer, inmunología, ratones, humanos, ensamblaje de genomas, metagenómica… Requerimos muchas aplicaciones diferentes y no todos los proveedores hacen todo. De ahí que tengamos un abanico de proveedores a los que acudimos en función del diseño experimental del proyecto.
Si el usuario decide utilizar uno de nuestros proveedores, lo que sí hacemos es un seguimiento y estar pendientes. Igualmente, cuando se obtienen los datos de secuenciación el usuario tiene la opción de llevárselos y analizarlos o que los analicemos nosotros. En cada caso se factura al usuario en función de las partes en las que hayamos intervenido y las horas que hayamos tenido que dedicarle.
¿Con qué tipos de proyectos trabajáis?
Por ejemplo, uno de nuestros usuarios, José María Requena, junto con Begoña Aguado, supervisora científica del Servicio de Genómica y Secuenciación Masiva y también usuaria del mismo, han publicado el primer transcriptoma completo del parásito Leishmania major. Además, hemos hecho genómica y mejorado los ensamblajes de genoma que había para varias especies del género Leishmania. Esto es interesante porque mejorar el conocimiento del genoma y el transcriptoma facilita el trabajo de las personas que trabajan para combatir la enfermedad.
Otro experimento muy habitual son proyectos de secuenciación de ARN en diferentes condiciones biológicas. Por ejemplo, tenemos proyectos en enfermedades degenerativas donde se hace transcriptómica en ratones modelo respecto a ratones normales. Esta tecnología permite hacer el análisis de forma global y encontrar genes candidatos a influir en el desarrollo de la enfermedad dependiendo de sus niveles de expresión.
En todos estos años, ¿cuál crees que fue el punto de inflexión hacia la incorporación de la secuenciación como herramienta diagnóstica en la práctica clínica?
Yo creo que ha sido progresiva. Las aplicaciones clínicas van siempre a rebufo del desarrollo tecnológico que se hace en investigación básica. En investigación básica no nos importa probar cosas que no siempre funcionan o que lo hacen en unas condiciones sí y en otras no. En el mundo clínico eso no es aceptable. Son dos mundos vinculados pero tienen reglas diferentes. El punto de inflexión yo creo que es que se haya publicado lo suficiente en investigación que se vea que es una técnica robusta y que esa aplicación específica para la práctica clínica se pueda validar. Hay aplicaciones que ya se utilizan, como la búsqueda de variantes, y hay otras, como la secuenciación de ARN en cáncer, que está ahora en desarrollo. En clínica, las tecnologías tienen que estar puestas a punto para incorporarse a la rutina.
¿Qué retos quedan por resolver en el ámbito de la secuenciación de genomas?
Secuenciar genomas es ya técnicamente bastante sencillo y económicamente relativamente barato. Desde el punto de vista técnico el problema está resuelto. Desde el punto de vista económico puede quedar por mejorar algo para que sea algo que se haga de forma rutinaria. Además, hay que tener en cuenta que habrá casos donde no es necesario secuenciar el genoma completo y hay que secuenciar el exoma o hacer expresión génica. Para mí, el gran reto está en la parte de análisis computacional. Estas tecnologías nos permiten obtener gran información por coste cada vez más reducido, pero en la parte clínica hay que traducir eso a un resultado operativo, que permita dar un diagnóstico o un pronóstico o sugerir un tratamiento. Ahí está la parte más compleja, porque hay enfermedades multifactoriales donde la secuenciación masiva lo que da es un riesgo. Creo que ahí va a ser importante la inteligencia artificial y la formación de especialistas. Los campos de la medicina e informática tienen que empezar a solaparse y hablarse entre ellos y la inteligencia artificial va a ser clave. Es la forma de identificar cosas que igual no son obvias para el mejor genetista o bioinformático. Hablamos de relaciones de muchos genes y probablemente será un algoritmo el que pueda decir “tú no lo ves pero esta persona tiene mucho riesgo de desarrollar esta enfermedad”.
¿Te atreves a hacer predicciones de futuro sobre cómo se planteará la secuenciación?
Es posible que surjan nuevas tecnologías pero ya hay algunas que son maduras y están consolidadas. Dentro de 10 años creo que se deberían haber creado nuevas especialidades. Ahora no hay una especialidad de genética, que es algo que se tendrá que resolver. En el futuro en los hospitales tendrá que haber equipos multidisciplinares: un médico que atienda al paciente y pida las pruebas, que puede o no ser genetista, un facultativo genetista que se encargue de hacer pruebas, un bioinformático que entienda como funciona la tecnología y trate los datos… En esto yo creo que tendrá que intervenir la inteligencia artificial. La forma de interpretar los datos será la forma que evolucionará bastante o nos encontraremos con una barrera importante.
¿Qué preguntas debería hacerse alguien que estuviera pensando en adquirir un sistema de secuenciación masiva?
La primera es si realmente lo debe adquirir. Lo que tiene que preguntarse es para qué lo va a utilizar, si ese equipo va a responder sus preguntas y si tiene la necesidad de tenerlo en su laboratorio. La decisión de comprar o externalizar hay que evaluarla cuidadosamente. Hay muchos equipos que se compran porque te dan dinero para un proyecto y cuando termina el proyecto se quedan criando telarañas. En la mayoría de los casos la respuesta será externalizarlo.
A menudo hay laboratorios que compran un equipo para algo concreto y luego se les queda pequeño o no sirve para otra parte del proyecto. También hay que tener en cuenta que estos equipos requieren mantenimiento anual que puede ser costoso. Y algo que se olvida siempre siempre es que los equipos los manejan personas. Si te dan dinero para un equipo pero no te dan dinero para pagar a quien tiene que preparar las librerías, hacer el análisis o encargarse de que se haga el mantenimiento, no sirve de nada. Son más importantes las personas que los equipos.
Si finalmente se decide que sí se necesita un equipo, lo que conviene es estudiar las tecnologías para ver cuál es la que interesa, hablar con casas comerciales y hablar con otros usuarios. Pero hay que ser muy cuidadoso. España está llena de equipos que no se usan o se usan muy poco y es muy difícil que comprándote y usando un solo equipo puedas producir secuencias al mismo precio que alguien que ha montado un servicio a nivel industrial. No quiero decir que no se deba, porque hay casos donde puede estar justificado comprar un equipo, pero hay que pensarlo bien.
¿Qué formación necesita un responsable de un servicio de secuenciación genómica?
Es necesaria alguna licenciatura o grado en ciencias de la salud o afines. Con un doctorado (aunque no es mi caso) mucho mejor, siempre que esté relacionado. Después te tienes que ir especializando e ir aprendiendo sobre la marcha. La universidad te da una base. Y si en el doctorado has utilizado las técnicas propias de la genómica, fenomenal. Después, lo tienes que ir aprendiendo, a base de cursos teóricos y trabajando y enfrentándote a los problemas, que es como realmente se aprende. También aprendemos a base de seguir o impartir cursos o asistiendo a congresos. Cuando tienes que dar un curso, te das cuenta de que tienes que explicar muchas cosas y explicarlas bien, lo que te obliga a reflexionar y aprender sobre el tema. Otra fuente estupenda son los boletines, páginas de noticias, webinars… Esa es una información al alcance de la mano prácticamente gratuita.
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