Analizan en un solo ensayo el efecto de cientos de mutaciones sobre la función de una enzima

Amparo Tolosa, Genotipia

 

Investigadores de la Universidad de Stanford han desarrollado un dispositivo que permite analizar de forma simultánea el efecto de cientos de mutaciones diferentes sobre una misma enzima. La herramienta diseñada facilita el estudio de cómo afecta la variación genética a la actividad de un enzima y podría acelerar la investigación sobre múltiples enfermedades, el desarrollo de fármacos y otras aproximaciones biotecnológicas.

análisis de enzimas
El dispositivo HT-MEK combina microfluidos y síntesis proteica fuera de las células para analizar, de forma simultánea, el efecto de cientos de mutaciones en la función de una enzima. Imagen: Daniel Mokhtari.

Las enzimas, moléculas que actúan como catalizadores biológicos y aceleran los cientos de eventos químicos que tienen lugar en nuestras células, son esenciales para la vida tal y como la conocemos. Cadenas de señalización, obtención de energía, degradación de productos tóxicos, metabolismo de nutrientes…Cada célula del organismo contiene miles de enzimas que aceleran las reacciones químicas necesarias para su funcionamiento e interacción con otras células.

La relevancia de las enzimas se conoce desde hace tiempo, lo que ha hecho posible que se conozca la estructura general y el modo de acción de muchas de ellas. Ahora, dos equipos de investigadores de la Universidad de Stanford han desarrollado una herramienta para profundizar de forma rápida en cómo influye la estructura en su función.

Hasta el momento, cuando se quería estudiar el efecto que tendría un cambio concreto en la estructura de una enzima sobre su función, lo habitual era generar bacterias modificadas genéticamente que produjeran la enzima, cultivarlas en grandes cantidades, purificar cada versión de la enzima de los diferentes cultivos y evaluar su función in vitro. El dispositivo diseñado por los equipos de Polly Fordyce, profesora de Genética y Bioingeniería en la Universidad de Stanford e investigadora en el Instituto ChEM-H de la universidad, y Daniel Herschlag, profesor de Bioquímica, Química e Ingeniería Química, reduce todo ese proceso y, lo que es más interesante, permite analizar de forma simultánea cientos de mutaciones en una misma enzima.

Microfluidos y síntesis de proteínas fuera de las células

Los investigadores han trabajado durante seis años para diseñar una plataforma de apenas siete centímetros cuadrados capaz de evaluar, de forma simultánea, el efecto de miles de mutaciones en la actividad de una única enzima.  HT-MEK, como se denomina el dispositivo (abreviatura de Cinética de Enzimas a gran escala por microfluidos, en inglés) combina dos tecnologías: microfluidos y síntesis de proteínas independiente a las células.

La tecnología de microfluidos permite crear una estructura con canales microscopios donde es posible manipular de forma precisa fluidos, y donde puede evaluarse la actividad enzimática en volúmenes mucho más pequeños de los habituales. Esta miniaturización permite que el dispositivo tenga 1568 microcámaras de análisis, lo que implica que se pueda analizar tantas formas o versiones de una misma enzima.

Por otra parte, la síntesis libre de proteínas facilita la producción directa de enzimas con las variaciones deseadas sin que sean necesarias células para producirlas. Polly Fordyce indica que han automatizado el sistema de tal forma que es posible utilizar impresoras que depositen en una lámina y de forma ordenada, puntos microscópicos de ADN sintético que codifican la enzima que se desea. Después se pueden alinear estos depósitos de ADN con cámaras de tamaño nanoscópico que incluyen la mezcla necesaria para producir las proteínas a partir del ADN. Posteriormente, se añade al dispositivo un agente químico que reacciona  con la enzima producida y puede informar a través de un biomarcador sobre la actividad de la enzima.

La combinación de microfluidos y síntesis proteica libre permite expresar y purificar de forma simultánea cientos de mutantes de una enzima determinada en cuestión de horas, así como obtener resultados sobre la actividad enzimática de cada variante en días.

Primeros resultados con la enzima PafA

La prueba de concepto presentada en el trabajo, publicado en Science, ha analizado 1036 versiones mutantes de la enzima PafA, con resultados muy interesantes.

Además de confirmar la importancia que los cambios de aminoácido pueden tener en el sitio activo de la proteína, por el que suele interaccionar con el sustrato, los investigadores han encontrado que algunas mutaciones alejadas de esta región pueden influir en la capacidad de la enzima para catalizar las reacciones químicas.

Este resultado remarca el potencial de la HT-MEK. En la actualidad, evaluar el efecto de una mutación sobre una enzima requiere tanto tiempo y recursos que solo suele analizarse el impacto de la variación en el sitio activo. HT-MEK ofrece una visión más amplia de cómo influye cualquier parte de la enzima en su actividad. “Es como si tomáramos una linterna y en lugar de apuntarla únicamente sobre el sitio activo la dirigiéramos hacia la enzima completa”, destaca Fordyce. “Cuando hicimos eso vimos un montón de cosas que no esperábamos”.

El equipo también ha descubierto que un mayor número de mutaciones de lo esperado producen alteraciones en el plegamiento de PafA que comprometen su capacidad catalítica. “Los bioquímicos han sabido durante décadas que puede ocurrir un mal plegamiento, pero ha sido extremadamente difícil identificar estos casos y más todavía estimar de forma cuantitativa la cantidad de este mal plegamiento”, ha señalado Craig Markin, investigador en los equipos de Fordyce y Herschlag.

Un futuro prometedor para el análisis de otras enzimas

De momento, la plataforma HT-MEK solo ha sido utilizada con una enzima. Los investigadores confían en que la rapidez y escala con la que pueden obtenerse resultados abran el camino hacia el análisis de otras enzimas.

La información que puede proporcionar HT-MEK sobre las enzimas, sumada al conocimiento ya disponible o a aproximaciones como la reciente predicción de estructuras proteicas a partir de la secuencia de aminoácidos podría derivar en múltiples avances para la biotecnología y la medicina.

Por ejemplo, la identificación de mutaciones situadas fuera del sitio activo que afectan a la función de la enzima puede ser relevante en el desarrollo de tratamientos dirigidos a enzimas, ya que podría identificar regiones alternativas cuando el sitio activo de una posible diana terapéutica no es una opción debido a su similitud con el de otras enzimas.

Referencia: Markin CJ, et al. Revealing enzyme functional architecture via high-throughput microfluidic enzyme kinetics. Science. 2021. DOI: http://dx.doi.org/10.1126/science.abf8761

Fuente: Stanford researchers develop tool to drastically speed up the study of enzymes. https://news.stanford.edu/2021/07/22/new-tool-drastically-speeds-study-enzymes/

 

 

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