Leire Iparraguirre^1*, Maider Muñoz-Culla^1-2* , David Otaegui^1-2

1 Unidad de Esclerosis Múltiple, Área de Neurociencias. Instituto de Investigación Sanitaria Biodonostia. 20014, San Sebastián, España.

2    Red Española de Esclerosis Múltiple (REEM). 08028, Barcelona, España.

*Ambas autoras han contribuido igualmente a este trabajo.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neurodegenerativa crónica autoinmune y desmielinizante del Sistema Nervioso Central que supone la primera causa de discapacidad por enfermedad en adultos jóvenes y que es más frecuente en mujeres. No sabemos por qué se inicia la enfermedad, pero sí sabemos que es una enfermedad compleja, en la que interactúan factores ambientales, como la exposición al sol o el tabaco, sobre una base de susceptibilidad genética. En los grandes estudios de asociación realizados por los consorcios internacionales no se han encontrado variantes causales, pero sí unas 200 variantes con poco impacto individual en el riesgo relativo, siendo la más ligada a la enfermedad el haplotipo HLD-DRB1501 (Muñóz-Culla et al 2013).

Desde la década de los 80, la historia natural de la enfermedad ha cambiado gracias al advenimiento de fármacos que actúan sobre el sistema inmune. En la actualidad, los clínicos disponen de una gran variedad de fármacos para el tratamiento de la parte inmunológica de la enfermedad, pero la gran heterogeneidad clínica de la enfermedad  y de la propia respuesta a los fármacos hace que haya una gran necesidad de biomarcadores que faciliten el diagnóstico precoz y ayuden al manejo terapéutico de la enfermedad en la práctica clínica. Durante años, se ha realizado un gran esfuerzo en la búsqueda de biomarcadores en sangre y otros fluidos biológicos, sin embargo, por el momento, pocos han llegado a incorporarse a la práctica clínica.

Son varios los trabajos que han estudiado la expresión de los genes de las células del sistema inmune, factor clave en el desarrollo de la enfermedad, demostrando que el transcriptoma global de las células inmunes es diferente entre pacientes y controles e incluso en diferentes estadios de la enfermedad (Muñóz-Culla et al 2013). Es por ello que se ha propuesto que la regulación del transcriptoma de las células inmunes desempeña un papel relevante en el desarrollo de la enfermedad, tanto en la evolución como en la interacción con el medio ambiente. En este contexto cobra especial importancia el estudio de los ARNs no codificantes (ncARN) como reguladores del transcriptoma. De hecho, cada vez son más los trabajos que evidencian la relación entre la EM y la desregulación de los microARNs, tanto en células inmunes y neuronales como en la sangre, demostrando su implicación en la enfermedad y su potencial como biomarcadores (Jagot et al, 2016).

En los últimos años se ha descubierto una nueva familia de ncARN, los ARNs circulares (circARNs). Estas moléculas de ARN son circulares y pueden estar formados por intrones (ciARNs) o por exones (ecircARN) pudiendo en algunos casos retener intrones entre estos (EIciARN). Inicialmente, se consideraron como meros subproductos del splicing alternativo de los mARN, sin embargo, se ha visto que son abundantes, estables y están muy conservados en mamíferos, proponiéndose para ellos una función biológica (Memczak et al, 2013). Aún no están del todo claras todas sus funciones pero varios estudios apoyan su papel en la red de regulación del transcriptoma, entre otros, funcionando como esponjas de los microARNs e incluso en un reciente trabajo se propone que pueden codificar proteínas (Pamudurti et al, 2017; Legnini et al, 2017). Además, su estructura circular les confiere una gran estabilidad en fluidos biológicos, característica que los hace especialmente buenos candidatos como biomarcadores. Es por ello que cada vez son más los estudios que proponen circARNs como biomarcadores de distintas enfermedades (enfermedades vasculares, neurológicas, cáncer…) (Kulcheski et al, 2016).

Este estudio publicado en Human Molecular Genetics es el primero que analiza mediante microarrays de expresión un total de 13.617 circARNs en muestras de sangre de pacientes con EM de tipo recurrente remitente (EM-RR)(el subtipo de enfermedad más común en los pacientes con EM (hasta el 85%)). De entre ellos, se encontraron 406 circARNs expresados de forma diferencial entre pacientes y controles sanos. Después de realizar una validación técnica de estos resultados mediante PCR cuantitativa (qPCR) se seleccionaron 4 circARNs para su posterior estudio en una cohorte más amplia de pacientes con RR-MS (20 EM-RR sin tratar vs 18 controles). Cabe destacar que en el caso de los circARNs, la validación por PCR cuantitativa debe tener en cuenta su circularidad y los cebadores han sido diseñados para que amplifiquen únicamente en el supuesto de que la molécula sea circular (cebadores divergentes) (Ver Figura).

Esta validación permitió confirmar que tanto el circ_0005402 como el circ_003452_2 se encuentran infraexpresados de forma significativa en pacientes con EM-RR demostrando su implicación en la enfermedad. Además, mediante el análisis de curva ROC, demostraron ser lo suficientemente específicos y sensibles como para funcionar como potenciales biomarcadores en EM-RR.

Además, se estudiaron estos dos circARNs en otras dos cohortes a fin de conocer si podrían estar implicados en los mecanismos de la enfermedad y valorar su poder predictivo en una fase prediagnóstica. Para responder la primera de las preguntas se estudiaron 21 pacientes en dos fases diferentes de la enfermedad, brote y remisión, para los que no se obtuvieron resultados significativos. Con el objetivo de responder a la segunda pregunta se comparó la expresión de estos dos circARNs en 10 individuos que habían sufrido un primer episodio de síntomas neurológicos conocidos como primer síndrome clínico aislado (SCA) (que podrían o no corresponder con un posterior diagnóstico de EM) y 10 controles sanos. En el caso de estos se observó la misma tendencia de infraexpresión encontrada para los EM-RR, lo cual apunta a que podrían servir como marcadores desde una fase temprana, a pesar de que el resultado no fue estadísticamente significativo.

Cabe destacar que ambos circARNs se forman a partir de un mismo gen, ANXA2 (Ver Figura), que curiosamente se encuentra también infraexpresado tanto en pacientes de EM-RR como en aquellos con SCA, con lo que podría ser también un buen biomarcador de la enfermedad. ANXA2 se ha visto relacionado con diferentes enfermedades, y se le asocia también con distintas funciones inmunes (Cañas et al, 2015). Además, se encuentra regulado por el microARN-155 previamente asociado con la neuroinflamación de la barrera hematoencefálica en la EM (Zhang et al, 2014).

A modo de resumen, en este trabajo se estudia por primera vez el perfil de expresión de circARNs en la EM y se proponen dos circARNs (circ_0005402 y circ_003452_2) como nuevos biomarcadores de la enfermedad. El estudio abre la puerta a una vía de estudio en las enfermedades autoinmunes y más concretamente en la esclerosis múltiple, demostrando además que el novedoso campo de los circARN, y sus relaciones con el transcriptoma, puede ofrecer claves para entender la regulación génica y cambiar nuestra forma de entender cómo se expresa el genoma.

Referencia: Iparraguirre L, et al. Circular ARN profiling reveals that circular ARNs from ANXA2 can be used as new biomarkers for multiple sclerosis. Hum. Mol. Genet. 26, 3564–3572. 2017. Doi: https://doi.org/10.1093/hmg/ddx243

Bibliografía:

Cañas F, et al. Annexin A2 autoantibodies in thrombosis and autoimmune diseases. Thromb Res. 2015 Feb;135(2):226-30. doi: 10.1016/j.thromres.2014.11.034.

Jagot F, Davoust N. Is It worth Considering Circulating microRNAs in Multiple Sclerosis? Front Immunol. 2016 Apr 5;7:129. doi: 10.3389/fimmu.2016.00129.

Kulcheski FR, et al. Circular RNAs are miRNA sponges and can be used as a new class of biomarker. J Biotechnol. 2016 Nov 20;238:42-51. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.09.011.

Legnini I, et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol Cell. 2017 Apr 6;66(1):22-37.e9. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.017.

Memczak S, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013 Mar 21;495(7441):333-8. doi: 10.1038/nature11928.

Muñoz-Culla M, Irizar H, Otaegui D. The genetics of multiple sclerosis: review of current and emerging candidates. Appl Clin Genet. 2013 Aug 8;6:63-73. doi: 10.2147/TACG.S29107.

Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017 Apr 6;66(1):9-21.e7. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.021.

Zhang J, et al. MicroRNA-155 modulates Th1 and Th17 cell differentiation and is associated with multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2014 Jan 15;266(1-2):56-63. doi: 10.1016/j.jneuroim.2013.09.019.