Amparo Tolosa, Genotipia

Desde el inicio de la pandemia de COVID-19 numerosos investigadores han redirigido sus esfuerzos hacia la búsqueda de soluciones frente al coronavirus SARS-CoV-2, en diferentes ámbitos: diagnóstico, tratamiento, cuidado de los pacientes…

La respuesta de la comunidad CRISPR a las nuevas necesidades globales ha sido también inmediata y se han adaptado diferentes herramientas CRISPR para proporcionar métodos alternativos de diagnóstico y ofrecer potenciales estrategias terapéuticas.

La tecnología CRISPR es conocida principalmente por su utilización como método para modificar el genoma.  No obstante, esa no es su única aplicación. Las herramientas derivadas de CRISPR son muy versátiles y en los últimos años diferentes investigadores han diseñado aplicaciones variadas destinadas a resolver diferentes cuestiones biológicas.

En el contexto de COVID-19 las principales aportaciones basadas en CRISPR se dividen en dos grandes grupos: la detección del virus y el desarrollo de terapias dirigidas a destruir al virus.

CRISPR en el diagnóstico de COVID-19

En estos momentos existen dos aproximaciones principales para utilizar CRISPR en la detección del coronavirus SARS-CoV-2. La base metodológica de ambas tecnologías fue desarrollada hace dos años para detectar moléculas de ARN y ADN de forma específica. Recientemente, la pandemia de COVID-19 ha impulsado su adaptación a la detección de SARS-CoV-2, una vez se conoció el genoma de este coronavirus.

El sistema CRISPR básico consta de dos elementos, una proteína nucleasa que corta ADN y un ARN guía que posiciona a la enzima hacia el lugar del genoma sobre el que debe actuar. La proteína otorga función y la molécula de ARN otorga especificidad a la herramienta. Teniendo en cuenta esta composición, la mayoría de las aplicaciones derivadas, incluidas las destinadas a detectar ARN y ADN, están basadas en modificar el componente funcional de CRISPR.

La primera aproximación es SHERLOCK, desarrollada en el laboratorio de Feng Zhang del Instituto Broad. SHERLOCK utiliza como elemento funcional la enzima Cas13a, que tiene como característica principal que al ser activada con la unión del ARN guía al fragmento complementario de ARN (es decir, cuando detecta la presencia del ARN diana), degrada los fragmentos de ARN presentes.

El funcionamiento básico de SHERLOCK es simple. En presencia de la secuencia de ARN a detectar, en este caso un fragmento del ARN del coronavirus, el ARN guía se une a su secuencia diana y activa a la enzima Cas13a, que comienza a degradar el ARN presente en la reacción. Para detectar si el ARN del virus está presente y se produce la degradación de ARN, los investigadores incluyen en la reacción unos pequeños fragmentos de ARN marcados, que al ser degradados emiten una señal que puede ser detectada mediante fluorescencia o reacción colorimétrica.

Tras el inicio de la pandemia y la caracterización del genoma de SARS-CoV-2 los investigadores adaptaron SHERLOCK para poder detectar el coronavirus en aproximadamente una hora. El protocolo utiliza 25 minutos para amplificar los ácidos nucleicos extraídos de la muestra, 30 minutos de incubación con los elementos de CRISPR y los ARNs con la sonda fluorescente y 2 minutos de incubación para obtener la lectura visual de la reacción.  La prueba está dirigida a detectar el gen de la proteína S, que interviene en la entrada del virus a las células humanas, y el gen Orf1ab, que codifica una replicasa del virus.

De momento, la detección del coronavirus mediante SHERLOCK no cumple los requisitos para ser utilizado en un contexto clínico, ya que no se ha evaluado en pacientes. Todavía debe ser optimizado y validado para este uso. Sin embargo, sí puede ser utilizado en con fines de investigación.

(ACTUALIZACIÓN 04-04-2020) Un equipo de investigadores del Instituto Broad ha combinado el sistema SHERLOCK con una plataforma de análisis de alta capacidad basada en chips y microfluidos. El resultado es CARMEN (Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids), una tecnología validada en muestras de pacientes  que puede analizar más de 1 000 muestras de forma simultánea.

La segunda tecnología de detección del coronavirus SARS-CoV-2 basada en CRISPR es DETECTR, desarrollada inicialmente en el laboratorio de Jennifer Doudna de la Universidad de California en Berkeley.

El sistema DETECTR original estaba diseñado para detectar únicamente ADN. La enzima seleccionada para aportar función, Cas12a, es una nucleasa que corta ADN y que, de forma similar a Cas13a, al ser activada, corta otras moléculas de ADN cercanas.  La detección se visualiza siguiendo el mismo mecanismo que en SHERLOCK, pero con ADN: se utilizan moléculas de ADN de cadena sencilla marcadas para liberar una señal fluorescente que también puede ser detectada mediante color en una tira de papel.

Un equipo de investigadores de la Universidad de California San Francisco y la empresa Mammoth Biosciences, de la que es cofundadora Jennifer Doudna, ha adaptado DETECTR para detectar SARS-CoV-2. En este caso, al tratarse de un virus de ARN, tras realizar la extracción de ARN de la muestra se realiza un paso previo en el que el ARN de la muestra se copia a ADN y se amplifica. Los genes del virus que se detectan son el gen N (que codifica la proteína N de la nucleocápside que compacta el ARN vírico) y el gen E (que codifica para una proteína de la envoltura del virus).

El método DETECTR sí ha sido validado en muestras clínicas de pacientes con diferentes infecciones virales, incluida COVID-19. No obstante, todavía no ha sido aprobada su utilización en diagnóstico clínico por la FDA.

Una de las ventajas de SHERLOCK y DETECTR es que pueden ser utilizados en cualquier laboratorio equipado con instrumental básico. Además, ambos métodos utilizan reactivos diferentes a los de las pruebas basadas en PCR, por lo que representan una alternativa a tener en cuenta cuando hay problemas de disponibilidad de los reactivos necesarios para estas pruebas, lo que ya está ocurriendo en algunos laboratorios. La principal limitación de momento es que todavía su sensibilidad es todavía menor a la de las pruebas basadas en PCR.

SHERLOCK y DETECTR no son los únicos métodos que utilizan CRISPR para detectar el coronavirus. Otros investigadores han utilizado estrategias similares. Por ejemplo, el pasado marzo se depositó en el repositorio público biorxiv un artículo en el que se explican los detalles de un sistema de detección “todo en uno”, AIOD-CRISPR, diseñado para llevar a cabo todos los pasos de las reacciones necesarias en un único tubo. El depósito en biorxiv implica que el trabajo no ha sido revisado por expertos todavía y sus resultados son preliminares. Mientras el artículo sigue los cauces habituales de revisión, sus creadores ya han manifestado que su objetivo a corto plazo es integrar AIOD-CRISPR en un chip de diagnóstico para desarrollar una plataforma rápida y asequible de diagnóstico. AIOD-CRISPR, diseñado en la Universidad de Connecticut, utiliza Cas12a y dos ARNs guía para aumentar su especificidad. Además, también utiliza amplificación isoterma y todo el proceso puede realizarse a 37ºC. Las reacciones positivas de la prueba se detectan mediante fluorescencia.

CRISPR en las terapias frente a COVID-19

Las herramientas CRISPR también pueden ser utilizadas para detectar y destruir virus de ARN como SARS-CoV2. Esta aplicación tiene sentido, ya que las aplicaciones CRISPR derivan precisamente de un sistema bacteriano que actúa para defender las bacterias de las infecciones víricas.

Tal y como resalta Lluís Montoliú en un reciente post de Naukas, una posibilidad de utilizar CRISPR contra el coronavirus sería aprovechar un sistema CRISPR de edición del genoma dirigido a ARN, para modificar el genoma del virus y alterar genes relacionados con su virulencia. Con esta estrategia, el virus quedaría desarmado y pasaría a ser inofensivo.

Otra opción más directa sería atacar y destruir el genoma del virus, aproximación que ya se planteó hace unos meses para hacer frente a otros virus, con resultados prometedores, al menos en cultivo celular.

Hace menos de un año, un equipo de Investigadores del Instituto Broad demostró que el sistema CRISPR podía utilizarse para atacar virus de ARN. En esa ocasión el equipo introdujo las instrucciones de la enzima Cas13 en cultivos de células humanas junto a ARNs guía específicos dirigidos frente a virus de ARN y observaron una reducción en la carga viral y la capacidad infectiva de los virus. Los investigadores dieron un paso más allá y combinaron esta estrategia con SHERLOCK, creando una herramienta antiviral para detectar y eliminar virus denominada CARVER (de Cas13-Assisted Restriction of Viral Expression and Readout, en inglés).

Si bien el Instituto Broad fue el primero en demostrar la efectividad de las herramientas CRISPR frente a los virus de ARN, el primer método para utilizarlas frente al coronavirus SARS-CoV-2 ha sido desarrollado en la Universidad de Stanford. Un equipo de investigadores dirigidos por Stanley Qi han diseñado PAC-MAN (de Prophylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells, o CRISPR antiviral profiláctico en células humanas).

El trabajo experimental relacionado con el diseño y evaluación de PAC-MAN ha sido publicado como preprint en el repositorio Biorxiv. El sistema utiliza la enzima Cas13d, seleccionada por su pequeño tamaño, su elevada especificidad y una alta actividad catalítica. Los investigadores han demostrado que PAC-MAN puede ser eficaz frente al virus de la gripe y partículas que simulan el virus SARS-CoV-2. En el experimento, el equipo utilizó una línea de células humanas epiteliales de pulmón modificadas para expresar de forma constante Cas13d a las que añadieron el ARNs guía dirigido frente a virus de ARN. A continuación, comprobaron la capacidad del sistema para inhibir los virus correspondientes. En el caso de SARS-CoV-2, ante la imposibilidad de utilizar el virus real, los investigadores simularon la infección con partículas de lentivirus que contenían el genoma del coronavirus. Al evaluar la herramienta frente al virus de la gripe, infectaron directamente con virus. En ambos casos obtuvieron resultados positivos de la acción de PACMAN frente al virus.

Los desarrolladores de PAC-MAN han dado incluso un paso más hacia adelante, al identificar seis ARNs guías que reconocen el 90% de los coronavirus que existen. La combinación de estos ARNs guías podría representar una importante oportunidad para responder rápidamente a posibles futuras pandemias causadas por coronavirus emergentes.

Los investigadores reconocen que la estrategia es todavía una prueba de concepto y deberán realizarse pruebas con SARS-CoV-2 infectivos y modelos animales. Uno de los principales retos a los que se enfrentan, común en las estrategias terapéuticas con CRISPR, será optimizar los métodos para hacer llegar los componentes de CRISPR o sus instrucciones al interior de las células. En cualquier caso, los investigadores destacan que PAC-MAN “representa una aproximación única para implementar en humanos una defensa antiviral rápida y amplia frente a patógenos emergentes para los que no hay vacunas efectivas”.

Las herramientas CRISPR se adaptan a la actualidad

Las estrategias CRISPR que se han presentado aquí tienen una aplicación directa en el diagnóstico o aproximación terapéutica a COVID-19. Sin embargo, también es destacable el esfuerzo de la comunidad CRISPR por proporcionar herramientas que faciliten la utilización de CRISPR en la pandemia de COVID-19. Un ejemplo destacable es el de las plataformas y aproximaciones que asisten en el diseño de los ARNs guía para SARS-CoV-2 y otros virus.

El sistema CRISPR surgió en bacterias como una defensa natural frente al ataque de los bacteriófagos. Identificado como tal por Francis Mojica en 2005 y convertido en herramienta molecular en 2012, en los últimos años ha sido adaptado según las necesidades de los investigadores. COVID-19 representa uno de los mayores desafíos a los que se ha enfrentado la comunidad científica en muchos años. Han surgido nuevas necesidades globales. Y la ciencia sigue ofreciendo posibles soluciones.

Referencias:

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Nguyen TM, et al. Virus against virus: a potential treatment for 2019-nCov (SARS-CoV-2) and other RNA viruses. Cell Res. 2020. Doi: https://doi.org/10.1038/s41422-020-0290-0

Abbott TR, et al. Development of CRISPR as a prophylactic strategy to combat novel coronavirus and influenza. bioRxiv. 2020. https://doi.org/10.1101/2020.03.13.991307 (publicado en Cell. Doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.020)

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Enabling coronavirus detection using CRISPR-Cas13: Open-access SHERLOCK research protocols and design resources. https://www.broadinstitute.org/news/enabling-coronavirus-detection-using-crispr-cas13-open-access-sherlock-research-protocols-and

Broughton JP et al. A protocol for rapid detection of the 2019 novel coronavirusSARS-CoV-2 using CRISPR diagnostics: SARS-CoV-2 DETECTR. https://mammoth.bio/wp-content/uploads/2020/04/200423-A-protocol-for-rapid-detection-of-SARS-CoV-2-using-CRISPR-diagnostics_3.pdf

A Point-of-Care CRISPR-based COVID-19 Diagnostic Could Be on the Horizon. https://www.technologynetworks.com/diagnostics/articles/a-point-of-care-crispr-based-covid-19-diagnostic-on-the-horizon-332794

CRISPR y coronavirus. https://montoliu.naukas.com/2020/04/03/crispr-y-coronavirus/

New CRISPR-Based COVID-19 Test Kit Can Diagnose Infection in Less Than an Hour. https://www.ucsf.edu/news/2020/04/417181/new-crispr-based-covid-19-test-kit-can-diagnose-infection-less-hour

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