Amparo Tolosa, Genotipia

Investigadores de los Institutos Gladstone, la Universidad de California Berkeley y la Universidad de California San Francisco han diseñado una prueba para detectar el coronavirus SARS-CoV-2 basada en la tecnología CRISPR cuyos resultados pueden ser interpretados con un teléfono móvil. El desarrollo y demostración del funcionamiento de la prueba, que puede detectar la presencia del virus en cinco minutos, han sido publicados en la revista Cell.

Desde el inicio de la pandemia, uno de los principales retos de la investigación científica ha sido diseñar herramientas que permitan identificar de forma eficaz, rápida y a gran escala a aquellas personas que han sido infectadas con el coronavirus y pueden infectar a otros.

La principal prueba para diagnosticar la presencia del virus es la PCR cuantitativa, aproximación que requiere personal cualificado, reactivos específicos y equipos de laboratorio. Numerosos laboratorios que utilizaban esta técnica en sus investigaciones han adaptado su equipamiento y personal a la detección del virus. Sin embargo, la demanda sigue creciendo y la disponibilidad de personal y equipos no es la misma en todas las regiones. En este contexto, la nueva prueba desarrollada por los Institutos Gladstone, la Universidad de California Berkeley y la Universidad de California San Francisco, que requiere menos reactivos, se resuelve en un cuarto de hora y puede ser leída con un aparato tan extendido como un teléfono móvil con cámara, amplia los diferentes escenarios en los que puede realizarse la prueba y  podría representar un punto de inflexión para el control de la pandemia.

“Una razón por la que nos emocionamos con el diagnóstico basado en CRISPR es el potencial para obtener resultados rápidos y precisos en el lugar donde se necesite”, señala Jennifer Doudna, investigadora de la Universidad de California Berkeley que ganó este año el Premio Nobel de Química por su participación en el desarrollo de herramientas de edición del genoma  y es codirectora del trabajo. “Esto es especialmente útil en lugares con acceso limitado a las pruebas o cuando es necesario realizar los test de forma rápida y frecuente. Podría eliminar muchos cuellos de botella que hemos visto con COVID-19”.

Método basado en CRISPR-Cas13a

El nuevo método de diagnóstico de SARS-CoV-2 está basado en la utilización de la enzima Cas13a, nucleasa que pertenece al sistema CRISPR-Cas, un mecanismo adaptativo de las bacterias para hacer frente a los virus que ha sido adaptado en una herramienta para modificar de forma específica el ADN.

Los sistemas CRISPR-Cas utilizados en los laboratorios suelen tener dos elementos principales: una enzima nucleasa que corta el ácido nucleico y una molécula de ARN que dirige a la enzima a una posición específica del genoma. Para desarrollar la prueba de detección del coronavirus los investigadores eligieron la nucleasa Cas13a por dos razones principales. En primer lugar, Cas13 corta ARN por lo que puede ser utilizada para detectar el genoma de ARN del coronavirus sin necesidad de transformar el ARN en ADN, como ocurre con la PCR. En segundo lugar, Cas13a tiene una propiedad muy interesante para el desarrollo del test: cuando es activada por la unión del ARN guía al ARN diana, en este caso el genoma del coronavirus, degrada otros fragmentos de ARN presentes a su alrededor, de forma inespecífica.

Respecto al segundo elemento principal, el ARN guía, la prueba de detección utiliza múltiples ARNs guía que reconocen diferentes posiciones del genoma del coronavirus, ya que esta estrategia aumenta la sensibilidad para detectar la presencia del virus.

Por último, los investigadores han añadido un tercer elemento para poder detectar el resultado: una sonda de ARN marcada que emite fluorescencia cuando el ARN es fragmentado.

El funcionamiento básico del nuevo método es sencillo. En presencia del coronavirus, los complejos formados por Cas13a y los diferentes ARNs guía se unen al genoma viral de forma específica y activan la actividad inespecífica de Cas13a que empieza a fragmentar las moléculas de ARN presentes, entre ellas las sondas de ARN. Al ser fragmentadas, las sondas se libera una señal fluorescente que puede ser leída e interpretada mediante un dispositivo adecuado.

Lectura del resultado con un teléfono móvil

Para complementar la sencillez de la prueba a nivel molecular y demostrar su portabilidad los investigadores han medido la fluorescencia emitida en presencia del virus con un dispositivo de fácil montaje que utiliza la cámara de un móvil para registrar el resultado.

“Elegimos utilizar teléfonos móviles como base para nuestro dispositivo de detección debido a que tienen interfaces de usuario intuitivas y cámaras de elevada sensibilidad que podemos utilizar para detectar la fluorescencia”, explica Daniel Fletcher, bioingeniero en la Universidad de California Berkeley. “los teléfonos móviles además, se producen en masa y de forma coste-efectiva, lo que demuestra que los instrumentos especializados de laboratorio no son necesarios para este ensayo”.

Detección directa y más rápida

La tecnología CRISPR ha sido utilizada anteriormente en el desarrollo de pruebas de detección del coronavirus. No obstante, las estrategias disponibles utilizan más pasos intermedios y requieren alrededor de una hora. Al no tener un paso de amplificación el nuevo método permite reducir los tiempos de análisis. Además, permite obtener medidas cuantitativas del ARN.

El equipo ha comprobado la eficacia del método en pacientes de COVID19 y ha encontrado que es capaz de detectar el virus en muestras positivas con 5 minutos de medida de la fluorescencia. En el caso de ARN viral aislado puede detectar hasta 100 copias de ARN del coronavirus por microlitro tras 30 minutos de tiempo de medida.

“Lo que realmente hace este test único es que utiliza una reacción en un único paso para testar el ARN viral, frente al proceso en dos pasos de las pruebas tradicionales de PCR”, indica Melanie Ott, directora del Instituto Gladston de Virología, profesora del Departamento de Medicina en la Universidad de California San Francisco y una de los directores del trabajo. “La química más simple emparejada con la cámara del Smartphone reduce el tiempo de detección y no necesita complejo equipamiento de laboratorio. Además, también permite al test realizar medidas cuantitativas en lugar de proporcionar simplemente un resultado positivo o negativo”.

De momento, la prueba de detección del coronavirus es experimental y su utilización no ha sido aprobada en un contexto clínico real. Sus creadores indican que podría ser adaptada a diferentes tipos de móviles y confían en desarrollar un sistema que aproveche la conectividad de los teléfonos y permita enviar resultados a sistemas informáticos basados en la nube sin comprometer la privacidad del paciente. La estrategia podría ser importante para rastrear contactos y estudios epidemiológicos. “Este tipo de prueba diagnóstica basada en smartphones podría tener un papel crucial en el control de la actual y futuras pandemias”, indica Ott.

Artículo de referencia: Fozouni P, et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 2020. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.001

Fuente: New CRISPR-Based Test for COVID-19 Uses a Smartphone Camera. https://gladstone.org/news/new-crispr-based-test-covid-19-uses-smartphone-camera

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