Alloza I.^1,2,3, Goikuria H.^1,3, Freijo M.M.⁴ y Vandenbroeck K^1,2,3

¹Neurogenomiks, Neuroscience Department, Faculty of Medicine and Odontology, Basque Country University, Leioa, Spain.

²Ikerbasque, Basque Foundation for Science, Bilbao, Spain.

³ACHUCARRO, Basque Centre for Neuroscience, Zamudio, Spain.

⁴Neurology Unit, Basurto University Hospital, Bilbao, Spain.

 

La enfermedad cerebrovascular se encuentra entre las primeras causas de muerte y minusvalía en todo el mundo. La estenosis carotídea o estrechamiento de la arteria que está causado por la formación de placa aterosclerótica es uno de los factores principales para desarrollar síntomas de un accidente cerebrovascular (ACV). Estas placas de ateroma pueden permanecer estables sin dar lugar a ningún síntoma (pacientes asintomáticos) o volverse inestables con tendencia a sufrir una ruptura y causar un accidente cerebrovascular (pacientes sintomáticos). Generalmente, los pacientes sintomáticos con estenosis (>70%) y los asintomáticos con estenosis (>80%) son tratados mediante endarterectomía para evitar futuros eventos cerebrovasculares. Sin embargo, recientemente se ha empezado a debatir si es conveniente realizar o no una endarterectomía en los pacientes asintomáticos (Spence et al., 2016).

Los tratamientos farmacológicos disponibles hoy en día influyen en la decisión de realizar o no una endarteretomía a algunos pacientes. No obstante, algunos pacientes asintomáticos no disminuirán el riesgo a sufrir un ACV solamente con un tratamiento farmacológico y por consiguiente estos se beneficiarían de la cirugía. Por tanto, la predicción de aquellos pacientes asintomáticos que puedan tener un mayor riesgo de desarrollar una placa inestable es decisiva para poder decidir cuál es el mejor tratamiento para dichos pacientes.

Los mecanismos precisos por los cuales una placa de ateroma se vuelve inestable no se conocen todavía. La placa de ateroma está compuesta por varios tipos celulares entre ellos las células de músculo liso (CML), las cuales participan en la patogénesis de la aterosclerosis (Doran et al., 2008). La identificación de marcadores biológicos que ayuden a reconocer a aquellos pacientes que poseen un alto riesgo de sufrir un ACV sería de gran apoyo en la clínica. A pesar de los esfuerzos realizados durante los últimos años aún no se han identificado marcadores cuyo uso se haya aplicado a la clínica (Simats et al., 2016).

En este trabajo, realizado por investigadores del laboratorio Neurogenomiks, de la Universidad del País Vasco UPV/EHU, en colaboración con investigadores del Hospital Universitario de Basurto, hemos analizado el transcriptoma completo, mediante la nueva técnica RNAseq, de células CML extraídas de placas estables (pacientes asintomáticos) e inestables (pacientes sintomáticos) con objeto de comprender el papel de estas células en la desestabilización de la placa de ateroma.

Para estudiar las diferencias del transcriptoma entre células de pacientes sintomáticos y asintomáticos se seleccionaron rigurosamente por los investigadores del Hospital Universitario de Basurto aquellos pacientes elegibles para ser incluidos en el estudio (i.e. edad, síntomas y ausencia de otras manifestaciones clínicas), 7 sintomáticos y 7 asintomáticos. El análisis de secuenciación masiva se realizó por Sistemas Genómicos (Valencia) en la plataforma de Illumina HiSeq2500.

En este trabajo se revela por primera vez los niveles de expresión de más de 20.000 genes y más de 70.000 isoformas en células CML provenientes de placas de ateroma de la carótida de pacientes S versus A. En particular, hemos identificado 67 genes y 143 isoformas diferencialmente expresadas en estos dos grupos de pacientes de manera significativa (valor P corregido con el método FDR <0.05). Para comprobar que estos datos son fiables, se realizó un estudio de validación donde se utilizó una técnica diferente, PCR cuantitativa digital, con la plataforma Fluidigm. Para ello se eligieron 38 genes de los 67 identificados en base a los niveles de expresión y posibilidad de diseñar cebadores específicos para PCR cuantitativa. De estos 38 genes se confirmó la misma tendencia de expresión en una cohorte de 25 muestras que incluyeron las 14 previas más 11 adicionales.

Por otra parte, con el objetivo de identificar relaciones funcionales entre los dos grupos se realizó un análisis de enriquecimiento con los datos obtenidos utilizando bases de datos como GO (Gene Ontology), KEEG (Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome), reactoma, DO (Disease Ontology), OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) and CCHMC (Cincinnati Childrens Hospital Medical Center). Entre las anotaciones más significativas con el mayor número de genes participantes se encontraron el desarrollo del sistema circulatorio y el desarrollo del sistema cardiovascular. Estas categorías se compararon entre las agrupaciones de genes con la herramienta ClusterProfiler, la cual permite visualizar las categorías biológicas comparadas entre las agrupaciones de genes. Se han identificado como categorías con el mayor número de GeneRatio y el menor valor P, la vía de señalización TGF-b, moléculas de adherencia celular (CMAs), la vía de guía de los axones y la de actividad de retinol deshidrogenasa.

Para completar el análisis bioinformático, se realizó un análisis de redes de interacciones funcionales, para lo cual primero se usaron varias fuentes de información como interacciones proteicas, genómica, vías, etc. con el programa GeneMANIA. Seguidamente, se realizó un análisis adicional con la herramienta MCODE con objeto de identificar una red central basándose en las redes funcionales generadas previamente con GeneMANIA. El agrupamiento final identificado con MCODE determina como procesos funcionales que distinguen entre sintomáticos y asintomáticos a las vías de señalización de TFG-beta, BMP, ALK1 e IDs.

Los miembros de la superfamilia TGF-beta están involucrados en varios procesos incluyendo proliferación celular, migración, producción de matriz extracelular, morfogénesis ósea, etc. BMPs pertenecen a esta familia y además participan en la señalización de ALK1 aumentando la proliferación celular. Algunas de las proteínas BMP tienen capacidad osteogénica, en concreto BMP2, que juega un papel en el  proceso de osificación (Morrell et al., 2016). En este estudio se determinó que las células SMCs de placas sintomáticas tienen valores de expresión de BMP2 significativamente más bajos que las asintomáticas, indicando que BMP2 presenta un papel beneficioso en la estabilización las placas de ateroma de la carótida a través de un proceso de morfogénesis ósea, promoviendo así un fenotipo protector. También se conoce que los genes IDs participan en la regulación del crecimiento celular, senescencia, angiogénesis y apoptosis, y en este estudio se reveló que los genes ID1 e ID4 mostraban un perfil de expresión en las placas sintomáticas indicativo de senescencia celular (Kyei et al., 2016). Asimismo, el análisis de expresión identificó otros genes relacionados con la mineralización ósea como la anidrasa carbónica (CA12), hormona tipo-hormona paratiroidea (PTHLH), péptido natriurético C (NPPC), reforzando la hipótesis de que CMLs de pacientes asintomáticos se beneficiarían del proceso de mineralización ósea.

En definitiva, el perfil de expresión génica combinado con el análisis de redes mostró que las CMLs de placas sintomáticas presentaban un fenotipo tipo osteogénico/calcificado, mientras que las CML de pacientes asintomáticos presentaban un fenotipo tipo senescente.

Referencia:

Alloza I, et al. RNAseq based transcriptomics study of SMCs from carotid atherosclerotic plaque: BMP2 and IDs proteins are crucial regulators of plaque stability. Sci Rep. 2017;7(1):3470. doi:10.1038/s41598-017-03687-9.

Bibliografia:

Doran AC, et al. Role of smooth muscle cells in the initiation and early progression of atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 812–819 (2008). doi:10.1161/ATVBAHA.107.159327

Kyei F, et al. Down-regulation of Id1 and Id3 genes affects growth and survival of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs). J Appl Biol Biotechnol Vol. 2016;4(2):23-29. doi:10.7324/JABB.2016.40204

Morrell NW, et al. Targeting BMP signalling in cardiovascular disease and anaemia. Nat Rev Cardiol. 2016;13(2):106-120. doi:10.1038/nrcardio.2015.156

Simats A, et al. Neuroinflammatory biomarkers: from stroke diagnosis and prognosis to therapy. Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Molecular Basis Dis. 1862, 411–424 (2016). doi: 10.1016/j.bbadis.2015.10.025

Spence JD, Naylor AR Endarterectomy, Stenting, or Neither for Asymptomatic Carotid-Artery Stenosis. N. Engl J Med 374, 1087–1088 (2016). doi:10.1056/NEJMe1600123