Desarrollado un método de amplificación del ADN basado en CRISPR

Amparo Tolosa, Genética Médica News

 

La amplificación del ADN mediante reacciones en cadena mediadas por una enzima polimerasa, técnica conocida como PCR, marcó un antes y un después en la biología molecular y ha sido decisiva para  el desarrollo de la Genética Médica.

Numerosas técnicas analíticas necesitan amplificar el fragmento de ADN de interés hasta alcanzar una concentración determinada para poder ser utilizadas con éxito. La técnica de PCR es una amplificación cíclica dirigida por oligonucleótidos de ADN o cebadores que se unen al ADN y delimitan la región de interés a amplificar. En cada ciclo de amplificación se aumenta la temperatura para separar las cadenas de ADN y se disminuye de nuevo para que se unan de nuevo los cebadores y la polimerasa pueda sintetizar nuevas cadenas. Estos cambios de temperatura deben ser precisos para garantizar que la amplificación se realiza de forma específica y la polimerasa puede trabajar. Por esta razón, las reacciones de PCR se llevan a cabo en termocicladores, instrumentos relativamente voluminosos y delicados, que además consumen bastante energía.

 

la PCR
La reacción en cadena de la polimerasa, una de las técnicas moleculares más extendidas y conocidas de todo el mundo, ha cumplido este mayo 35 años.

 

Un equipo de investigadores de la Universidad de Shanghai en China acaba de desarrollar una alternativa a la amplificación del ADN por PCR. La nueva técnica está basada en el mismo mecanismo de defensa bacteriano del que deriva el sistema CRISPR de edición del genoma, no requiere cambios de temperatura y puede llevarse a cabo a 37ºC, lo que podría facilitar la amplificación del genoma fuera de los laboratorios.

CRISPR deriva de un sistema de defensa inmunitario bacteriano por el que las bacterias incorporan en su genoma pequeños fragmentos del ADN de los agentes víricos que las han atacado. Cuando la bacteria entra en contacto de nuevo con estos virus, los fragmentos de ARN producidos de su ADN guían a enzimas especializadas en cortar ADN hacia el ADN de los virus, que es cortado y por tanto eliminado. Una de estas enzimas, Cas9, se utiliza en el sistema de edición del genoma CRISPR. La nueva técnica de amplificación del ADN también se aprovecha de su actividad guiada y específica, con algunas modificaciones.

¿Cómo funciona la amplificación del ADN basada en CRISPR?

El método consta de diversos componentes. Por una parte, los investigadores han desarrollado una nueva versión de Cas9 que en lugar de cortar la hebra de ADN por completo introduce un único corte en una de las cadenas. Además, la especificidad para amplificar un fragmento de ADN viene mediada por los dos ARNs guía que se unen a Cas9 para formar dos complejos diferentes. Los últimos componentes son una enzima polimerasa que puede sintetizar ADN a 37ºC y dos pequeños oligonucleótidos de ADN conocidos complementarios a los extremos de la secuencia de interés que actuarán como cebadores extra.

PCR CRISPR
Mecanismo de funcionamiento de la PCR basada en CRISPR. La enzima Cas9 modificada es dirigida a la región de interés por medio de los ARNs guía. Los complejos Cas9 introducen dos cortes sencillos en una de las cadenas de la doble hélice. A continuación la polimerasa sintetiza ADN desde el primer punto de corte y va desplazando el ADN, que se libera cuando llega al segundo punto de corte. Posteriormente, la polimerasa puede actuar de nuevo en el fragmento de ADN con los cortes y el ADN liberado puede actuar de molde para sucesivas rondas de amplificación, gracias a dos cebadores extra. Imagen: Rosario García, Medigene Press SL.

La amplificación funciona de la siguiente forma: en primer lugar, los complejos Cas9-ARN localizan la región a identificar, se unen a ella e introducen un corte en una de las hebras de ADN; a continuación, la enzima polimerasa empieza a sintetizar ADN a partir del primer corte, desplazando durante el proceso la antigua hebra de ADN, hasta que esta es liberada al alcanzar el segundo punto de corte. La nueva cadena sintetizada volverá a sufrir cortes y a ser liberada y las cadenas liberadas pueden actuar como moldes para rondas sucesivas con los cebadores extra, aumentando de forma exponencial el número de moléculas amplificadas.

Los investigadores han utilizado esta técnica de amplificación con ADN bacteriano y han estimado que la técnica permite detectar y amplificar 2 copias de ADN en un volumen de 20 microlitos.

Aunque todavía queda por confirmar su eficacia en todo tipo de ADN y su adaptabilidad a todo tipo de laboratorios, el nuevo método de amplificación de ADN podría resultar de gran utilidad en aquellos contextos en los que no es posible disponer de un termociclador al uso, especialmente en la detección de ácidos nucleicos específicos. “Considerando su superior sensibilidad y especificidad, así como su simpleza de implementar, rapidez y rasgos isotérmicos, Cas9nARN muestra gran potencial para convertirse en un ensayo rutinario para la detección cuantitaiva de ácidos nucleicos en estudios básicos y aplicados”, concluyen los investigadores.

Referencia: Wang T, et al. An RNA‐Guided Cas9 Nickase‐Based Method for Universal Isothermal DNA Amplification. Angewandte Chemie. 2019. Doi: https://doi.org/10.1002/anie.201901292