Amparo Tolosa, Genética Médica News

Un equipo de investigadores de la Universidad de Yale acaba de adaptar el conocido sistema de edición genómica CRISPR para poder modificar de forma específica múltiples genes en un periodo de tiempo menor de lo que se necesita en la actualidad.

El sistema CRISPR, que ha revolucionado las tecnologías de edición génica por su simplicidad y eficiencia, consta de dos elementos principales: una enzima capaz de cortar el ADN y una molécula de ARN complementaria al fragmento de ADN que se pretende modificar, que dirige a la enzima hacia el sitio donde debe ejercer su función. La rotura en la doble cadena de ADN es reparada por los mecanismos de reparación de las células. Sin embargo, a menudo durante el proceso se introducen pequeñas inserciones o deleciones en el material hereditario, inhabilitando el producto funcional del fragmento de ADN original y creando por tanto, una mutación en el sitio deseado.

En el trabajo, los investigadores plantean el diseño de un sistema CRISPR-Cas9 inducible –esto es que pueda activarse cuando el investigador lo desee y se mantenga activo únicamente el tiempo necesario para llevar a cabo su función –que además, pueda aplicarse a múltiples dianas. Con esta estrategia, el equipo pretendía combinar las estrategias de los sistemas CRISPR-Cas9 inducibles y de diana múltiple, y reducir posibles efectos de la edición genómica sobre partes del genoma no deseadas.

Para conseguir un sistema CRISPR-Cas9 inducible, el equipo desarrolló un vector vírico en el que la expresión de Cas9 estaría inducida por la presencia de doxiciclina. Además, el mismo vector contenía la información para producir proteína verde fluorescente EGFP, lo que permitía visualizar en qué células se expresaba Cas9. Otra ventaja de disponer de EGFP es que las células del cultivo donde el sistema esté actuando (y se expresen Cas9 y EGFP) podrían ser separadas por técnicas de citometría de flujo.

En paralelo, los investigadores diseñaron un sistema para poder obtener en un único paso un vector vírico que incluyera los diferentes ARN guía dirigidos a distintos genes.

Con el objetivo de demostrar la eficiencia de su estrategia, el equipo lo utilizó para inactivar la expresión de tres genes, KDM5A, KDM5B y KDM5C de forma simultánea, tanto in vitro, en cultivo celular como in vivo en un modelo animal. In vitro, los investigadores obtuvieron una línea de células HeLa con buen nivel de inducción de EGFP (y por tanto de Cas9) a partir del tratamiento con doxiciclina y las transfectaron con el vector lentivirus con la información necesaria para producir los ARNs guía para los tres genes. In vivo, introdujeron las células en ratones y suplementaron el alimento de los mismos con doxiciclina. En ambos casos, observaron una disminución de la expresión de los genes diana.

Además, comprobaron que al limitar la producción y acción de Cas9 durante un periodo de tiempo concreto, se minimizaba su potencial acción sobre otras regiones del genoma.

La plataforma CRISPR desarrollada por los investigadores presenta varias ventajas: consigue un silenciamiento génico muy completo, disminuye el tiempo necesario para generar células mutantes, permite monitorizar (mediante EGFP) el proceso y funciona tanto en líneas celulares humanas y de ratón como en xenotrasplantes.

“Esta plataforma puede ser utilizada para utilizar como diana inducible múltiples genes,” señala Qin Yan, profesor de patología en la Universidad de Yale y director del trabajo. “Simplificamos lo que solía ser un proceso muy complicado haciéndolo más eficiente y mucho más simple para editar más de un gen a la vez – grandes ventajas que no tienen otros sistemas.”

“Esta plataforma acortará nuestros experimentos de forma significativa, de un mes a una semana,” añade Jian Cao, primer autor del trabajo. “Es muy eficiente.”

Referencia: Cao J, et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nuc Ac Res. 2016. Doi: 10.1093/nar/gkw660

Fuente: Genome-editing ‘toolbox’ targets multiple genes at once. http://news.yale.edu/2016/07/26/genome-editing-toolbox-targets-multiple-genes-once