“Desarrollo de una terapia innovadora contra la distrofia miotónica” es un proyecto de la plataforma de micromecenazgo Precipita de la Fundación española para la Ciencia y la Tecnología, FECYT.

La distrofia miotónica (DM) es una enfermedad genética degenerativa que se considera rara porque afecta a 1/8000 nacidos, y es la atrofia muscular más común en adultos. Dado que la odisea diagnóstica puede tardar hasta 14 años en algunos casos, es probable que los casos que se diagnostiquen sean sólo la punta del iceberg. Aunque es una enfermedad multisistémica, afecta sobre todo a sistema nervioso, músculo y corazón. Los pacientes sufren atrofia, miotonía y debilidad muscular. Hoy en día, el manejo de los síntomas es la única forma de preservar la calidad de vida de las personas que viven con esta enfermedad.

En su forma más común (DM1), la aparición de síntomas ocurre durante la adolescencia y las personas afectadas tienen una vida útil significativamente más corta de 48-55 años, lo que significa que los pacientes combaten las manifestaciones de la enfermedad durante décadas, requiriendo asistencia de un grupo de profesionales de la salud incluyendo médicos, fisioterapeutas, terapeutas ocupacionales y logopedas. Por su prevalencia y la gravedad de los síntomas del paciente, encontrar una cura para la DM es una necesidad social.

¿Por qué?

Esta enfermedad se origina a partir de una expansión de trinucleótidos CTG en la región 3’UTR del gen DMPK que, tras su transcripción, forma horquillas CUG que se consideran tóxicas porque secuestran proteínas muy importantes durante el desarrollo, como las proteínas MBNL, que son reguladoras del splicing alternativo mecanismo molecular de edición post-transcripcional mediante el cual se obtienen varios mARN (ARN mensajero, aquel que será traducido a proteínas) a partir de una única secuencia de ADN que ha sido transcrito a un transcrito primario de mARN. La falta de MBNL provoca alteraciones en el metabolismo del RNA que originan los síntomas de la enfermedad. Los estudios en modelos animales han demostrado que el aumento de MBNL revierte la enfermedad y su sobreexpresión es bien tolerada. Por este motivo, los esfuerzos de nuestro grupo se han centrado en desarrollar una estrategia terapéutica que permita aumentar los niveles de MBNL en los pacientes de DM. Además, de ser efectiva, este tipo de terapias podrían diseñarse frente a otras enfermedades en las que se ha visto que la falta de función de MBNL esté implicada en la patogenia, tales como SCA8, ELA, hepatocarcinoma etc….

¿Y ahora qué podemos hacer?

Unas de las estrategias más innovadoras y exitosas para modular la expresión génica son las terapias basadas en miRNAs. Los miRNAs son moléculas de 20-23 nucleótidos implicadas en la regulación de más del 70% de los transcritos humanos. La actividad de los miRNAs puede ser inhibida por oligonucleótidos antisentido con secuencia complementaria total o parcial a un miRNA (llamados antimiRs).

Nuestro grupo ha descubierto que la expresión de MBNL en condiciones normales está reprimida por ciertos microRNAs y que la inhibición de dichos microRNAs por moléculas antisentido puede ser terapéutica, ya que permite un aumento de la expresión de MBNL que rescata fenotipos característicos de DM en modelos de la enfermedad.

Las pruebas de concepto que hemos generado para validar esta estrategia terapéutica son las siguientes: i) En un modelo en Drosophila de DM1 en el que la expresión de expansiones CTG origina atrofia y defectos locomotores, la expresión transgénica de antimiRs, rescata estos fenotipos (Cerro-Herreros et al., 2016, Scientific Reports). ii) En células humanas, identificamos dos miRNAs (miR-23b y miR-218) que reprimen la expresión de MBNL. Estos microRNAs están muy conservados entre ratón y humano y se expresan en músculo humano y de ratón. iii) Tanto en mioblastos DM1 como en un modelo murino de DM1, el tratamiento con antimiRs en el medio o por administración subcutánea, respectivamente, aumentó la expresión de MBNL y rescató defectos moleculares, histopatológicos y funcionales que eran consecuencia de la falta de función de esta proteína. Estos datos, nos animan a proponer este tipo de moléculas antimiRs como terapia eficaz contra DM y a implicarnos en su desarrollo.

PRECIPITANDO ¿A qué se dedicará tu aportación?

Nuestro objetivo es desarrollar una terapia contra la Distrofia Miotonica. Para ello, proponemos evaluar la eficacia terapéutica de antagomiRs reguladores de MBNL, en un modelo murino de la enfermedad.

Para ello, llevaremos a cabo los siguientes objetivos específicos:

• Si logramos alcanzar el objetivo mínimo, realizaremos un estudio de dosis-respuesta en el modelo en ratón de la enfermedad. Para ello, los oligonucleótidos antagomiR-23b y antagomiR-218 se administrarán por separado por vía subcutánea en tres dosis a seis ratones HSA[LR] cada uno (machos de 5 meses de edad) por dosis. Servirán como control un grupo de seis ratones HSA[LR] que recibirán vehículo solo (PBS) y cinco ratones normales (cepa FVB, background genético de HSA[LR]) de la misma edad y sexo. Las tres dosis estarán entre un rango mínimo de 1 mg/kg y máximo de 50 mg/kg. Los tratamientos se analizarán a los 4 días post-inyección e incluirán: (1) realizar medidas de miotonía (inserciones de electrodo según descrito en Kanadia et al. 2006) y fuerza muscular al inicio y final del tratamiento; (2) obtención de muestras de músculo esquelético (qd, cuádriceps; gt, gastrocnemius), para extracción de miRNA, RNA total y proteínas y para el procesado histológico. Comprobaremos el silenciamiento de sus miRNA diana en musculatura esquelética (RT-qPCR para miRNAs) y los niveles de MBNL1 y MBNL2 a nivel de transcrito (RT-qPCR) y proteína (ELISA). Seguidamente evaluaremos el rescate de alteraciones en el splicing alternativo de transcritos musculares mediante RT-PCR semicuantitativa y cuantificaremos el porcentaje de núcleos centrales en ratones control y tratados en secciones musculares teñidas con hematoxilina-eosina. El conjunto de estos datos permitirá concluir si hay correlación entre dosis y mejora de fenotipos musculares, así como sugerir una dosis óptima (aquella a la que mayor rescate observamos) y una dosis mínima a la que se observa mejora de fenotipos (MED, minimum effective dose).
• En el caso de alcanzar el importe óptimo, realizaremos estudios de dosis múltiples, así como de toxicidad y activación del sistema inmune. Tras determinar la dosis óptima, para estudiar la duración de la actividad ejercida por los antagomiRs, administraremos dicha dosis (que puede ser diferente para cada antagomiR), también por vía subcutánea, a un grupo de 20 ratones que iremos sacrificando sucesivamente a los 15, 30, 60 y 90 días post-inyección (5 animales por punto temporal). Las determinaciones que se realizarán después del sacrificio serán las explicadas en el objetivo anterior y los resultados nos permitirán determinar cuánto tiempo post-inyección se mantiene el efecto de los compuestos. Para estudiar la toxicidad del tratamiento en los ratones, se obtendrá sangre total al sacrificar a los animales en todos los tratamientos anteriores y se evaluarán marcadores de toxicidad hepática (FA, GGT, GPT), renal (ácidos biliares, urea, creatinina) y muscular (CPK) y se realizará una necropsia visual del aspecto y tamaño de los principales órganos. La evaluación el estado de activación del sistema inmunitario se realizará mediante medidas de citoquinas inflamatorias con kits ELISA comerciales. Las medidas de interleuquinas (IL)1beta e IL6 y Toll-like receptor (TLR)3 y TLR7 nos darán una idea de la respuesta innata mientras que IL12 e IL10 lo harán de la respuesta adaptativa.
• Por último, si conseguimos superar el objetivo óptimo, realizaremos un estudio del efecto de nuestros antagomiRs en mioblastos DM1, para comprobar que los resultados obtenidos se corroboran en este modelo de la enfermedad. En este caso se administrarán los antimiRs en el medio celular y posteriormente se realizará un estudio de toxicidad y de los cambios de expresión de MBNL1 y MBNL2 mediante RT-PCR (transcrito) y ELISA (proteína). Estos datos nos permitirán apoyar los resultados previos y poder contactar con alguna farmacéutica que se encargue de continuar con la fase clínica del tratamiento.

 ¿Por qué este proyecto es singular y único?

Lo que hace único a nuestro proyecto es:

– La indicación: La DM es una enfermedad rara grave y muy debilitante que no tiene tratamiento por lo que la urgencia por la generación de soluciones en este campo es evidente.

– La diana terapéutica: nuestra investigación ha descubierto nuevas moléculas implicadas en la patogenia de la enfermedad que no se conocían hasta ahora por lo que nuestra aproximación terapéutica es muy diferente al de otras que se han iniciado previamente.

– El tipo de molécula que se va a desarrollar: aunque es de síntesis química, no se trata de una pequeña molécula, sino de un RNA modificado. La ventaja es su gran especificidad, menor incidencia de efectos adversos, no es necesaria la química médica ni la formulación para la mejora de la molécula y los rangos de farmacodinámica y farmacocinética ya son conocidos.

– El equipo: nuestro grupo de investigación es líder mundial en la investigación sobre la Distrofia miotónica, llevamos años dedicados a la investigación de las bases moleculares y a la búsqueda de terapias para esta enfermedad. Tenemos por tanto la experiencia y los contactos con clínicos, pacientes, asociaciones de pacientes, investigadores y empresas del sector, necesarios para promover el desarrollo de una futura terapia. El líder del proyecto ha recibido además formación específica en otros ámbitos como protección de propiedad intelectual, desarrollo regulatorio y desarrollo de negocio, lo cual favorecerá la transferencia de la investigación que se lleve a cabo.

Formamos parte de algo más grande

Nuestro grupo forma parte de la Oligonucleotide Therapeutics Society (OTS), de la red COST Action “Delivery of Antisense RNA Therapeutics” (DARTER) (CA17103) y de la red Treat-NMD. En los tres casos, se trata de redes de profesionales mundiales que permiten que todos los avances dentro del campo de las terapias basadas en oligonucleótidos, y los referidos en particular a enfermedades neuromusculares, puedan llegar a los pacientes de la forma más rápida posible, garantizando un buen desarrollo de estas investigaciones.

Gracias a estas redes, nos mantenemos en contacto con diferentes profesionales internacionales cuyo trabajo se complementa con el nuestro, permitiendo así que nuestra investigación se vea respaldada a nivel mundial.

¿A quién beneficia este proyecto?

Con este proyecto se podría conseguir mejorar la calidad de vida de las más de 250.000 personas afectadas por esta enfermedad (solo en Europa), así como la de sus familias. No se trataría de una cura sino de un tratamiento crónico, pero de administración subcutánea por lo que sería un tratamiento poco invasivo. Por otro lado, el desarrollo de terapias basadas en oligonucleótidos es un campo en ferviente expansión y todo desarrollo que se lleve a cabo servirá para ayudar a acelerar desarrollos futuros que utilicen oligonucleótidos de química similar para cualquier otra enfermedad, ya que, en este tipo de moléculas, no es la secuencia sino la química la que condiciona su farmacodinámica y farmacocinética. Por último, permitirá la realización de una tesis doctoral dentro de este ámbito, permitiendo la introducción de un nuevo investigador en el campo del desarrollo de terapias para enfermedades raras.