Gustavo Dominguez Bernal, Universidad Complutense de Madrid

“Nanoestrategias en nuevas terapias y vacunas frente a Leishmaniosis” es un proyecto de la plataforma de micromecenazgo Precipita de la Fundación española para la Ciencia y la Tecnología, FECYT.

El objetivo principal del proyecto es desarrollar un nuevo compuesto basado en la nanobiotecnología, eficaz en el tratamiento y prevención de la leishmaniosis canina. El control de esta enfermedad en los perros es una de las medidas más importantes en la lucha frente a la leishmaniosis humana.

Leishmania infantum es el agente etiológico causante de la leishmaniosis visceral zoonótica (LV) en seres humanos y otros mamíferos, siendo el perro el principal reservorio de ámbito doméstico en países de la Cuenca Mediterránea. Se trata de una enfermedad de transmisión vectorial, cuyo responsable es un pequeño insecto díptero de la subfamilia Phlebotominae conocido como flebótomo.

Según datos de la Organización Mundial de la Salud se estima que 310 millones de personas están en riesgo de sufrir leishmaniosis en todo el mundo, registrándose unos 300.000 casos anuales de LV y 20.000 muertes al año.

Aunque la incidencia de la LV humana en la Cuenca Mediterránea hasta el presente siglo era relativamente baja (un rango de 5–200 casos por año en cada país), el número de casos ha aumentado y está teniendo lugar una notable expansión de la enfermedad. Por tanto, el desarrollo de una vacuna efectiva constituye una prioridad de primera magnitud.

Cabe destacar que el perro doméstico está considerado como el más importante reservorio de leishmaniosis, no sólo en los países de la zona Mediterránea sino también en otras partes de Europa donde se ha extendido la enfermedad. En muchas regiones de España la leishmaniosis canina se presenta con carácter endémico y representa un importante problema, tanto de índole veterinaria como de salud pública dado el carácter zoonótico del parásito L. infantum.

Aunque actualmente aún no existe ninguna vacuna capaz de prevenir la leishmaniosis humana, sí existen tratamientos antileishmaniales, pero aun así, distan de ser satisfactorios necesitando numerosas dosis y presentando efectos secundarios, además de una baja eficacia en áreas endémicas debido al desarrollo de parásitos resistentes. Posiblemente los fallos en los tratamientos se deben a que solo se dirigen contra el parásito, sin tener en cuenta el contexto inmunopatológico que determina el cuadro clínico de la enfermedad en numerosas formas clínicas de la leishmaniosis, por lo que además de desarrollar nuevos fármacos antileishmaniales, es deseable que los esfuerzos se centren en inmunomoduladores que controlen y reduzcan la gravedad de la patología desencadenada por la respuesta inmunitaria inducida por L. infantum.

Nanotecnología PLGA y vacuna HisAK70: candidato vacunal e inmunoterapéutico

Recientemente, el grupo INMIVET ha desarrollado una vacuna de DNA efectiva frente a varias formas de leishmaniosis. Se trata de un plásmido vacunal (pVAX-HisAK70), libre de resistencia a antibiótico, y que codifica siete genes que codifican proteínas previamente descritas como importantes inmunógenos de L. infantum. En el modelo murino de leishmaniosis cutánea (LC), HisAK70 es capaz de eliminar el 100% de la carga parasitaria visceral, y además es capaz de reducir en un 62% la carga parasitaria en el modelo murino de LV. Este último hallazgo ha dado lugar a una publicación en la revista “Parasites & Vectors”.

Para que una vacuna sea efectiva frente a Leishmania es preciso que se instaure una respuesta inmunitaria celular de larga duración, y para ello se necesita la activación de los instrumentos de defensa de la respuesta innata que implican a macrófagos (MØ) y células dendríticas DC. Las DC cumplen un papel esencial como células presentadoras de antígeno siendo un nexo entre las respuestas inmunitarias innatas y las adquiridas. Durante el contacto con los agentes patógenos, las DC inmaduras interaccionan a través de sus receptores de reconocimiento con diversos antígenos (Ag). Después de esta interacción, las DC sufren un proceso de maduración durante el cual aumentan la expresión en superficie de MHC de tipo I y II, así como de moléculas coestimuladoras (CD40, CD54, CD80 y CD86). De forma simultánea a su maduración, las DC transportan los agentes microbianos hacia los linfonódulos y hacia el bazo, donde establecen sinapsis inmunológicas con los linfocitos T para promover fenotipos específicos de tipo Th1/Th2 (TCD4+), citotóxico (TCD8+) o regulador (Treg).

Recientemente se han descrito numerosas estrategias vacunales y terapéuticas empleando DC frente a patógenos intracelulares y frente a tumores con beneficios clínicos. Nuestro grupo ha demostrado recientemente cómo HisAK70 vehiculada y expresada en DC induce una reducción de la carga parasitaria en un modelo murino de VL. Sin embargo, su uso está limitado por la preparación laboriosa y con algunas complicaciones técnicas además de disponibilidad de donantes. Estos inconvenientes se están superando mediante la utilización de sistemas de transporte de péptidos o proteínas que puedan ser dirigidos directamente a las DC in vivo.

Desde una perspectiva biotecnológica, el desarrollo de las nanopartículas ha supuesto una revolución en el campo de la administración de fármacos, aunque también se están empleando como vehículos de proteínas y ADN, frente a diversas enfermedades. Las nanopartículas (NP) de PLGA (ácido poliláctico-coglicólico) son las más ampliamente utilizadas, están constituidas por monómeros de ácido láctico y glicólico, y entre sus ventajas caben señalar las siguientes: son biodegradables, son biocompatibles, impiden la degradación del fármaco, minimizan su toxicidad y facilitan su liberación sostenida, incluso su modificación en superficie favorece una mejor interacción inmunitaria y el direccionamiento de las nanopartículas al órgano deseado, mejorando su eficacia de liberación. Además, están aprobadas por la Food and Drug Administration (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos EMA, con lo que la Nanotecnología se constituye en la actualidad en una apuesta metodológica esencial en la lucha frente a la enfermedad.

Las NP representan un nuevo abordaje para la liberación de vacunas con actividad inmunológica e inmunoterapeútica debido a su capacidad para ser ingeridas por células fagocíticas e inducir respuestas inmunitarias, la internalización en células sumidero, como los MØ, que ofrecen una pobre capacidad para estimular las células T comparados con las DC, se puede evitar mediante la pegilación con polietilenglicano, que además, prolonga su vida media in vivo. Las NP-PLGA per se poseen propiedades adyuvantes suboptimas in vivo, por lo que inducen una pobre maduración de las DC. Con el fin de superar esta limitación, se ha descrito la encapsulación de ligandos de receptores Toll-like (TLRL) que han dado lugar a la inducción de una respuesta celular eficaz mediada por linfocitos Th1 con capacidad para controlar tumores o desafíos virales.

¿Qué podemos hacer? ¿Por qué este proyecto es singular y único?

El presente proyecto se elabora a partir de las siguientes hipótesis: el desarrollo de vacunas y tratamientos eficaces frente a una infección por L. infantum implica no sólo el establecimiento y mantenimiento de una respuesta inmunitaria de memoria de larga duración (para lo que se necesita una activación de DC que desencadenen una activación de células CD8+ y el predominio de una respuesta de tipo CD4+ Th1 de larga duración productores de IFNγ y de TNFα), sino un estímulo de la respuesta inmunitaria temprana en el punto de entrada inicial del protozoo, en el que la activación de neutrófilos, monocitos inflamatorios y DC, junto con la presencia de proteínas de la saliva del vector es crucial para el futuro de la infección.

Proponemos desarrollar una formulación inmunogénica dirigida específicamente a las DC como principales nexos de enlace entre la respuesta innata y adaptativa en la que se vehicule un cóctel proteico junto a agonistas de los receptores Toll-like.

Además, existe una gran necesidad de desarrollar nuevos compuestos que superen los problemas actuales de los fármacos antileishmaniales que presentan inconvenientes muy importantes como la toxicidad, los elevados costes, la necesidad de numerosas aplicaciones y el desarrollo de resistencias parasitarias. Nuestra hipótesis considera que los fallos se pueden asociar a que solo se intenta luchar frente a Leishmania sin aliviar la respuesta inmunopatológica, que conduce a la enfermedad, en la mayoría de las formas clínicas de leishmaniosis, por lo que sin desmerecer el esfuerzo en la búsqueda nuevos compuestos activos frente al parásito, en este proyecto nos proponemos aplicar una nueva formulación como estrategia inmunoterapéutica que pueda reducir la gravedad de la patogenia y signos clínicos de la leishmaniosis.

Por todo lo anteriormente descrito, y coincidiendo con la línea emergente iniciada por el IP del proyecto, se plantean como objetivos generales: por un lado, el desarrollo nanotecnológico de  un  candidato  inmunoprofiláctico  e  inmunoterapéutico  eficaz  frente  a  la  infección    por infantum en un modelo experimental de infección en ratones BALB/c.

Antecedentes del equipo investigación con relación a la propuesta

Nuestro grupo tiene una amplia experiencia en el desarrollo de estrategias de vacunación frente a leishmaniosis, así como en el establecimiento de distintos modelos experimentales de leishmaniosis para la valoración del éxito de vacunas y tratamientos antileishmaniales. Con respecto a estas materias, tenemos concedidas dos patentes: PCT ES 2012 000321 (vacuna multicomponente para su uso frente a la infección por Leishmania spp. en mamíferos) y PCT WO 2010/092219A1 (Uso de cepas de Leishmania Δhsp70-II como vacuna). Y en el marco del proyecto financiado por el MINECO, del que esta propuesta es una continuación, hemos conseguido obtener una vacuna multicomponente de DNA ya publicada, herramientas vacunales para nuevas vacunas de DNA  y un cóctel integrado por 7 proteínas (en 4 subunidades) con excelentes resultados en el modelo murino.

Actualmente, nos encontramos terminando de analizar los ensayos de inmunización frente a leishmaniosis canina propuestos en los últimos objetivos del proyecto AGL2013-44100R, precursor al proyecto que solicitamos en la pasada convocatoria (AGL2017-87436R).

En la actualidad, el IP del proyecto propuesto ha consolidado relaciones de colaboración con los investigadores responsables de la Unidad de Entomología Médica del Instituto de Salud Carlos III de Madrid. Maribel Jiménez y Ricardo Molina que van a colaborar en la extracción de homogeneizados de glándulas salivares (SGH) del vector. Por otro lado, el IP del presente proyecto ha iniciado una reciente colaboración con un grupo investigador pionero en Nanotecnología PLGA, el grupo liderado por la Dra. Mercedes Fernández Arévalo, perteneciente al Departamento de Farmacia y tecnología farmacéutica de la Universidad de Sevilla con el que existe un acuerdo de colaboración para realizar los estudios de funcionalización y caracterización de las nanopartículas.

¿A quién beneficia este proyecto?

El carácter zoonótico y la distribución mundial de la leishmaniosis la convierten en una patología de gran interés, en la que una investigación transversal debe integrarse bajo el concepto de “Una Sola Salud”.

Teniendo en cuenta las consecuencias del impacto humano sobre la alteración del medio natural y la transmisión parasitaria, los resultados que se deriven de este proyecto podrían tener una aplicación inmediata en lo referente a la adopción de estrategias vacunales e inmunoterapéuticas basadas en la  nanobiotecnología como aproximación práctica para evitar y reducir el impacto de las consecuencias de la transmisión parasitaria en el principal reservorio y a consecuencia de ello sobre los seres humanos.

¿Qué precipitarás con tu ayuda?

Si se consiguiese el apoyo financiero suficiente para lograr el importe mínimo solicitado (4.000 €) se destinaría a la obtención y funcionalización de las nanopartículas de PLGA que se pretenden utilizar como formulación terapéutica y protectora. Para ello, se necesita encargar la síntesis de los péptidos inmunogénicos, los adyuvantes que modulen la respuesta inmunitaria celular, y el anticuerpo que dirija las nanopartículas a las células dianas. La formulación obtenida se representa en este esquema:

Si se lograse un apoyo financiero superior al importe mínimo o si se alcanzase el importe óptimo (25.000 €) se valorarían las capacidades inmuprofilácticas e inmunoterapéuticas de las formulaciones construidas en cultivos celulares in vitro y, en función de sus resultados, en el modelo murino de infección intradérmica con L. infantum.

Si se lograse un apoyo financiero que superase el importe óptimo y en función de los resultados obtenidos en el modelo murino, se destinaría a la evaluación de estas capacidades en un ensayo clínico en el modelo canino.

¿Quieres saber más?

Puedes contribuir a este proyecto en:

https://www.precipita.es/proyecto/la-nanobiotecnologia-en-la-lucha-contra-la-leishmaniosis.html