Ibáñez, M.¹, Carbonell-Caballero, J.², Sanz, MA. ¹, Dopazo, J.^2,3,4, Cervera, J.^1,5

¹Servicio de Hematología, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, España

²Departamento de Genómica Computacional, Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, España

³Nodo de Genómica Funcional Instituto Nacional de Bioinformática, CIPF, Valencia, España ⁴Bioinformática de Enfermedades Raras (BIER), CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER)

⁵ Unidad de Genética, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Spain

La leucemia promielocítica aguda (LPA) es un subtipo de leucemia mieloide aguda singular por la presencia del gen de fusión PML/RARA, consecuencia de la de la translocación cromosómica t(15;17)(q22;q12), y por sus características morfológicas, citogenéticas y moleculares únicas. Sin embargo, pese a la presencia del gen de fusión, diversos estudios funcionales en modelos murinos han sugerido que el reordenamiento cromosómico es condición necesaria pero no suficiente para reproducir por completo el fenotipo leucémico, precisando de otras alteraciones moleculares. Otras anomalías cromosómicas adicionales a la t(15;17) y mutaciones en diversos genes han sido consideradas como potenciales eventos secundarios en hasta el 40% de los casos de LPA. Sin embargo, poco se sabe acerca de la naturaleza y el papel exacto de estos eventos cooperantes en LPA.

Recientemente, estudios realizados mediante secuenciación masiva han identificado en la LPA un elevado número de mutaciones en 135 genes diferentes, pero de forma no recurrente, excepto para los genes FLT3, WT1 y KRAS. Estos estudios, han puesto en evidencia que las leucemias, en general, presentan una media de mutaciones somáticas por paciente entre 3 y 7 veces menor que los tumores sólidos. En concreto, en el caso de las LPA el número de mutaciones somáticas recurrentes esperadas por paciente es casi dos veces menor que en otras neoplasias mieloides. Además, debido a la presencia del reordenamiento, todo parece indicar que estas mutaciones serían cooperantes entre sí, con alteraciones génicas relevantes todavía por definir, haciendo de la LPA un modelo idóneo para el estudio de alteraciones responsables de la leuceomogénesis.

Considerando todo ello, nos planteamos identificar nuevas mutaciones somáticas que cooperen con PML/RARA en la leucemogénesis, mediante una combinación de secuenciación exómica completa (Whole Exome Sequencing, WES) de muestras pareadas en el momento del diagnóstico y en la remisión completa en pacientes con LPA de novo y la re-secuenciación dirigida de genes candidatos en una cohorte de validación. Finalmente, utilizamos el análisis funcional de redes para seleccionar un subgrupo de genes candidatos con potencial implicación en la leucemogénesis.

Para ello, se realizó WES en muestras pareadas (somática/genómica) de 5 pacientes con LPA de novo. El análisis bioinformático primario se realizó con un protocolo propio diseñado al efecto y la selección de variantes del análisis secundario tuvo en cuenta la presencia en población sana, efecto en la proteína, grado de conservación y asociación funcional. Las variaciones adquiridas deletéreas se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. Noventa pacientes con LPA se seleccionaron para la validación de los resultados. En 65 de ellos se analizó la recurrencia de las variantes identificadas y en 25 la secuencia codificante completa de 97 genes seleccionados (17 procedentes de nuestros resultados de WES y 80 de publicaciones recientes LPA). La priorización de los genes candidatos se realizó mediante un análisis de enriquecimiento de rutas génicas (SNOW, Babelomics).

Del análisis de los datos obtenidos mediante la WES, identificamos un total de 309.498 variantes, con una cobertura media de 61,5x. Tras el análisis primario se seleccionaron 96 alteraciones somáticas de alta calidad. El análisis secundario disminuyó esta cifra a 50 variantes (media: 10 variantes/caso; rango: 7-14) de las que se confirmaron 17 SNVs no sinónimas y 1 indel en 17 genes (ADC, ALPK3, APPL1, CSNK1A1L, FAM171A1, FBLN1, FILIP1L, FLT3 (n=2), GJB7, HMGCR, KIAA0317, MDN1, NR4A2, ORC3, PRICKL2, PTPRT y ZNF518B). No se observaron mutaciones recurrentes, excepto para las mutaciones de FLT3, ni cuando las mutaciones fueron analizadas en una cohorte independiente de 65 pacientes con LPA de novo.

Cuando nos centramos en la re-secuenciación dirigida de 97 genes mediante el panel génico, se detectaron 219 variantes con efecto deletéreo en 72 genes diferentes (media: 9,5 mutaciones/caso; rango: 1-47), presentando 46 de ellos mutaciones en más de un paciente (rango 2-15) y 39 la misma mutación en más de un paciente. Quince de estos genes presentaron un porcentaje de mutaciones significativamente mayor que los controles sanos descritos en la base de datos 1000 genomas (P≤0,05).

Posteriormente, realizamos un estudio del enriquecimiento funcional de los 46 genes recurrentemente mutados y se clasificaron de acuerdo a su categoría funcional, normalizando cada categoría por el número de genes que las componían. Esto nos permitió discriminar aquellas categorías que presentaban más mutaciones debido a tener un mayor de componentes (Figura 1B). Cuando se analizó la tasa de mutación intrínseca de cada gen y la comparamos con la tasa de mutación en nuestros pacientes, observamos que las alteraciones en los genes responsables de la ubiquitinación y del espliceosoma presentaban un mayor porcentaje de mutaciones en pacientes con LPA.

Consecutivamente, ejecutamos la priorización de genes candidatos, lo que nos permitió definir un modelo in silico que agrupaba las alteraciones encontradas en base a su interacción física, regulación, funcionalidad y rutas celulares alteradas. El análisis incluyó el interactoma de los 46 genes candidatos poniendo de manifiesto que 17 de estos 46 genes, estaban más relacionados entre sí de lo esperado por el azar (P = 0,02), y por tanto presentaban un gran potencial de implicación leucemogénica.

Por último, revaluamos el valor de nuestros análisis de redes funcionales añadiendo los casos de LPA que fueron analizados previamente por el TCGA. La combinación de ambas cohortes (n = 45) mostró una acumulación de mutaciones en un total de 59 genes. A pesar del aumento en el número de genes, los mismos genes candidatos obtenidos del análisis de nuestra cohorte permanecieron significativamente implicados en nuestro modelo definido in silico.

En resumen, este estudio describe el análisis de mutaciones genéticas de la mayor cohorte de pacientes con LPA realizado hasta la fecha. Tras el análisis de priorización de genes y de rutas génicas, encontramos 8 genes candidatos (STAG2, U2AF1 SMC1A, USP9X, IKZF1, LYN, MYCBP2 y PTPN11) con un gran potencial de implicación en la patogénesis de la LPA. De hecho, recientemente se ha descrito el papel que desempeñan algunos de estos genes candidatos en la leucemogénesis, como es el caso de PTPN11, STAG2 y U2AF1. Además, hemos definido un modelo funcional in silico del interactoma de la LPA, que sugiere que el número o la combinación de mutaciones presentes en cada paciente puede no ser tan importante como las alteraciones causadas en las distintas categorías funcionales, provocadas por varias mutaciones no necesariamente recurrentes. Finalmente, a pesar de que nuestro estudio revela la nueva implicación de genes candidatos en pacientes con LPA, está claro que la comprensión del número total y de la distribución clonal de las mutaciones en esta enfermedad es todavía limitada y que el descubrimiento de nuevos genes de la enfermedad es potencialmente alto.

Referencia bibliográfica:

Ibáñez M, , et al. The Mutational Landscape of Acute Promyelocytic Leukemia Reveals an Interacting Network of Co-Occurrences and Recurrent Mutations. PLoS ONE. 2016. 11(2): e0148346. doi: http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0148346