La edición precisa del genoma llega a las mitocondrias

Amparo Tolosa, Genotipia

 

Investigadores del Instituto Broad de la Universidad de Harvard y la Universidad de Washington han desarrollado una nueva herramienta de edición genética con la que es posible introducir cambios precisos en el ADN mitocondrial. El sistema de edición, que utiliza una toxina bacteriana modificada y proteínas de unión específica al ADN, es capaz de acceder al interior de las mitocondrias, lo que hasta el momento era una barrera técnica para otras estrategias de edición genómica.

 

Una nueva herramienta de edición genética permite introducir cambios precisos en el ADN mitocondrial. Imagen: modificada de Thomas Deenrick, National Center for Microscopy and Imaging Research (NIH, EE.UU.)

 

La nueva herramienta de modificación del ADN mitocondrial, cuyos detalles han sido publicados en Nature,  permitirá mejorar el conocimiento sobre el papel del genoma de las mitocondrias en la función celular y en procesos como el envejecimiento o el cáncer. Además, representa un paso importante hacia el desarrollo de estrategias terapéuticas para hacer frente a las enfermedades producidas por alteraciones en el ADN mitocondrial.

El diseño del editor del genoma mitocondrial gira alrededor de una toxina bacteriana con actividad de enzima citidina deaminasa que facilita la conversión de citosina a uracilo. Esta proteína actúa de forma similar a los editores de bases ya utilizados en edición genómica, con una importante diferencia: actúa sobre el ADN de doble cadena sin cortar la molécula. Esta propiedad y su función no dependiente de ARN han facilitado su adaptación al contexto del ADN mitocondrial.

Un objetivo: modificar el ADN mitocondrial de forma precisa

Ciertos cambios en el material hereditario de las mitocondrias, orgánulos responsables de producir la energía necesaria para la célula, pueden causar graves enfermedades y trastornos metabólicos.

Hasta el momento, los esfuerzos para diseñar estrategias terapéuticas frente a las enfermedades causadas por mutaciones en el ADN mitocondrial estaban centrados en eliminar las copias de ADN mitocondrial defectuoso. Cada célula tiene entre cientos y miles de mitocondrias, que a su vez incluyen  diferentes copias de su ADN, por lo que pueden convivir copias de ADN mitocondrial dañado con copias sin mutaciones patológicas. En estos casos, la proporción de copias con mutaciones es un factor crítico para el desarrollo de la enfermedad, de forma que solo cuando se supera un límite se manifiesta la enfermedad.

Las estrategias para eliminar copias de ADN mitocondrial estaban basadas en la utilización de nucleasas diseñadas y programadas para reconocer y cortar el ADN mitocondrial con la mutación. Con esta aproximación, en los modelos experimentales se conseguía reducir el número de moléculas de ADN mitocondrial con mutaciones hasta unos niveles no patológicos. Sin embargo, no permitían introducir cambios concretos.

El reto: acceder al interior de la mitocondria

Cualquier estrategia para modificar el genoma mitocondrial debe considerar que los agentes moleculares necesarios deben cruzar dos barreras físicas: la membrana celular y la doble membrana mitocondrial. La primera no es problema. Ya existen mecanismos para hacer llegar las instrucciones o componentes proteicos de los diferentes  sistemas de edición al interior de las células.  El problema es hacerlos llegar al interior de la mitocondria.

Por ejemplo, los sistemas de edición basados en CRISPR son conocidos por poder introducir cambios precisos en el ADN, pero no son eficaces para modificar el ADN mitocondrial. Uno de los elementos clave de las herramientas CRISPR es el ARN guía, que posiciona al otro componente principal, la enzima que corta el ADN, en la secuencia concreta a modificar y las mitocondrias no tienen mecanismos para transportar ARN a su interior.

La nueva aproximación no utiliza ARN.  Recurre de nuevo a proteínas programables para identificar el fragmento de ADN a modificar y utiliza una toxina  bacteriana modificada para introducir el cambio específico. Además, la herramienta incorpora una secuencia de señalización hacia la mitocondria, que equivale a un pasaporte molecular al interior de la mitocondria.

Un complejo multiproteico con diferentes módulos funcionales

El sistema para editar el ADN mitocondrial consta de varios elementos. La especificidad por la secuencia es proporcionada por las proteínas TALE que pueden diseñarse para reconocer un fragmento concreto del genoma mitocondrial (o cualquier otro genoma).  No obstante, el elemento central es la toxina bacteriana  DddA  que cataliza la transformación de la citosina del ADN a uracilo.

La toxina DddA, obtenida de la bacteria patógena Burkholderia cenocepacia, fue identificada por el laboratorio de Joseph Mougous en la Universidad de Washington. A diferencia de otras enzimas con actividad citidina deaminasa, DddA actúa directamente sobre ADN de doble cadena, lo que la convertía en una firme candidata para la edición del genoma mitocondrial.

Nos dimos cuenta de que las propiedades de este agente de combate bacteriano podía permitirle ser emparejado con un sistema dirigido al ADN no basado en CRISPR, planteando la posibilidad de crear editores de bases que no dependan de CRISPR o ARNs guía”, señala David Liu, investigador del Instituto Broad, profesor en el Instituto Médico Howard Hughes y uno de los directores del trabajo, además de ser conocido por desarrollar diversas herramientas de edición del genoma, como la reciente Prime Editing. “Podría permitirnos finalmente realizar edición precisa del genoma en uno de los últimos rincones de la biología que permanecía intocable mediante esa tecnología, el ADN mitocondrial”.

Para eliminar su toxicidad e impedir su función de forma inespecífica, los investigadores separaron la toxina en dos mitades que solo actúan cuando están en regiones adyacentes del ADN. Las dos mitades están fusionadas a las proteínas TALE, que las posicionan en la región del ADN a modificar.

DddA facilita la conversión de citosina a uracilo, que a todos los efectos será considerado como una timina en la replicación del ADN. Para evitar que el uracilo sea reconocido como “no ADN” y reemplazado, al complejo formado por la proteína TALE fusionada a una mitad de toxina DddA se han añadido inhibidores de la uracilo glicosilasa.

Cómo funciona el editor de ADN mitocondrial

La herramienta, que ha sido denominada DdCBE (de Editor de base citosina derivado de DddA, en sus siglas en inglés) consta de dos complejos cada uno de los cuales tiene: una proteína TALE capaz de reconocer un fragmento de ADN, la mitad de la toxina Ddda, un inhibidor proteico de la uracilo glicosilasa y una secuencia de aminoácidos que dirige al complejo hacia el interior de la mitocondria.

 

edición ADN mitocondrial
Cómo funciona el editor de ADN mitocondrial.

 

Una vez en el interior de la célula, el pasaporte molecular para acceder a la mitocondria hace que el complejo llegue a la matriz de la mitocondria. En el interior, el complejo, que ha perdido los aminoácidos de señalización, se une de forma específica a una región del ADN, gracias al reconocimiento por parte de las proteínas TALE. La unión de dos complejos a regiones adyacentes del ADN hace que las dos mitades de la toxina DddA queden juntas, recuperando su actividad catalítica, que facilita la conversión de la citosina hacia la que se ha diseñado el complejo en uracilo, que será interpretado como una timina durante la replicación del ADN.

Los investigadores han evaluado la efectividad de DdCBE en la edición de cinco genes mitocondriales, donde han obtenido entre un 4.6  y un 49% de eficacia, según diferentes variables del sistema.

De momento la herramienta está limitada a transformar las citosinas del genoma mitocondrial que tienen una timina delante de ellas. No obstante es una mejora considerable respecto a no poder modificar nada del genoma de las mitocondrias. Además, los estudios preliminares indican que no se producen mutaciones no deseadas en el genoma nuclear, uno de los aspectos que más preocupan a los investigadores respecto a la edición genómica.

Aplicaciones futuras

La nueva estrategia para modificar el ADN mitocondrial de forma precisa proporciona un método para crear modelos de estudio de enfermedades causadas por mutaciones en el genoma mitocondrial. Hasta el momento, los modelos dependían de las mutaciones identificadas en pacientes o en la naturaleza y no se podían obtener nuevos.

Esta es la primera vez en mi carrera que hemos sido capaces de diseñar una edición precisa en ADN mitocondrial”, indica Vamsi Mootha, miembro del Instituto Broad, investigador en el Instituto Médico Howard Hughes y profesor en el Hospital General de Massachusetts, que ha participado en el estudio. “Es un salto considerable hacia adelante. Si podemos crear mutaciones dirigidas podemos desarrollar modelos para estudiar variantes asociadas a enfermedades determinar qué papel tienen realmente en la enfermedad y rastrear los efectos de los fármacos en las rutas implicadas”.

Respecto a su potencial en el desarrollo de tratamientos para enfermedades genéticas, todavía es muy pronto para plantear cualquier aplicación terapéutica. Los responsables del estudio señalan que será necesario investigar más para determinar qué factores afectan a la especificidad de la herramienta o en qué sistemas biológicos funcionará. “Un editor de genoma mitocondrial tiene el potencial a largo plazo de desarrollarse en una terapia para tratar enfermedades mitocondriales y tiene más valor inmediato como herramienta que los científicos pueden utilizar para  modelar mejor las enfermedades mitocondriales y explorar cuestiones fundamentales sobre la biología mitocondrial y la genética”, destaca Joseph Mougous.

Artículo original: Mok BY, et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 2020. Doi: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2477-4

Fuentes:

Aushev M y Herbert M. Mitochondrial genome editing gets precise. Nature. 2020. DOI:

New molecular tool precisely edits mitochondrial DNA. https://www.broadinstitute.org/news/new-molecular-tool-precisely-edits-mitochondrial-dna

Scientists make precise gene edits to mitochondrial DNA for first time. Ledford H. Nature. 2020. DOI: http://dx.doi.org/10.1038/d41586-020-02054-5

 

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