José Martín Nieto, Universidad de Alicante
“Investigación de genes causantes de enfermedades raras en tumores cerebrales” es un proyecto de la plataforma de micromecenazgo Precipita de la Fundación española para la Ciencia y la Tecnología, FECYT.
Los glioblastomas multiformes son tumores cerebrales con una incidencia en España por encima de la media europea, que conllevan una bajísima supervivencia para los pacientes, y para los cuales no existen terapias eficaces. El tratamiento personalizado de los enfermos requiere el desarrollo de nuevos biomarcadores moleculares útiles para la clasificación de los tumores, así como de nuevas terapias farmacológicas más específicas.
Existen trabajos recientes indicativos de que distintos genes causantes de las distrofias neuromusculares congénitas llamadas distroglicanopatías (en adelante, genes asociados a DGPs) podrían codificar proteínas cuyo mal funcionamiento en el interior de las células podría conducir al desarrollo de distintos tipos de cáncer, entre ellos el glioblastoma.
Nuestro grupo posee una gran experiencia en el estudio de estos genes y proteínas. En este proyecto nos proponemos investigar su posible función en el núcleo de células de glioblastomas en cultivos primarios y secciones de biopsias cerebrales. Ello conllevaría el estudio de su localización intranuclear, niveles de expresión, genes diana que regulan y proteínas con las que interaccionan. La información obtenida se intentaría correlacionar con las características moleculares y celulares ya catalogadas de cada tumor cerebral: resistencia a radio y quimioterapia, índice de proliferación celular, mutaciones en distintos genes del genoma, etc.
Se espera que este proyecto proporcione una base de conocimiento útil, por un lado para el descubrimiento de nuevos biomarcadores de respuesta a tratamiento y de la progresión tumoral en glioblastomas, y por otro de cara a la identificación de nuevas dianas terapéuticas.
¿Por qué este proyecto es singular y único?
Nuestra propuesta es original porque pretende unificar en un solo proyecto el estudio de genes que causan enfermedades raras y la investigación del cáncer. Partimos de la idea, de la cual ya existen evidencias experimentales, de que un mal funcionamiento de determinados genes asociados a DGPs, que pretendemos identificar, podría desencadenar en personas adultas el desarrollo de tumores cerebrales.
Se sabe muy poco sobre la patogénesis de los glioblastomas, es decir, sobre los mecanismos por los cuales se originan y cómo avanzan, por lo que creemos que el estudio de los genes asociados a DGPs en los tumores cerebrales podría arrojar luz sobre dichos procesos. Asimismo, existe una gran proporción de pacientes en los cuales no se detectan anomalías genéticas heredadas, por lo que resulta evidente que es preciso encontrar nuevos genes y proteínas involucrados. Estudiando alteraciones en estas moléculas en los tumores (en sus niveles de expresión, localización intracelular, interacciones con el ADN y otras proteínas, etc.) podríamos obtener información tanto sobre cuál es su función en condiciones de salud como sobre por qué su disfunción conduce al desarrollo y progresión del cáncer cerebral.
¿Qué podemos hacer?
La función del distroglicano (DG) de anclaje de la célula a la matriz extracelular la hace una proteína candidata a estudio en procesos tumorales, ya que la pérdida del DG en sí mismo o de su glicosilación es un factor de riesgo que permite a la célula abandonar el entorno del tumor de origen, adquirir propiedades migratorias e invasivas, y poder establecer tumores secundarios. Además, en base a todas las evidencias anteriores, nuestro grupo y otros han propuesto que los genes y proteínas implicados en DGPs (glicosiltransferasas) podrían ejercer desde el núcleo de las células cerebrales una función moduladora de la proliferación celular. Este papel lo llevarían a cabo, bien glicosilando el a-DG u otras proteínas nucleares, bien interaccionando con proteínas reguladoras (factores de transcripción, reguladores epigenéticos) de la expresión de los genes implicados en estos procesos. Por ello, si dichas proteínas fallan, no desempeñarían adecuadamente su papel controlador en el cerebro y otros tejidos, ya sea directo o indirecto, facilitando la aparición de un tumor y/o el avance de su crecimiento.
Todas estas consideraciones y evidencias hacen lógico, y a la vez de gran relevancia, el estudio del DG y las proteínas asociadas a DGPs en el cáncer y su posible correlación con el grado de malignidad, invasividad y metástasis. Para ello utilizaremos líneas celulares derivadas de GBMs primarios en cultivo, y secciones de biopsias cerebrales de pacientes con GBMs. En estos materiales biológicos analizaremos:
- La localización en el núcleo de las proteínas asociadas a DGPs ya mencionadas, cuantificando sus niveles de expresión. Emplearemos para ello técnicas de western blotting e inmunocito/histoquímica acoplada a microscopía confocal de fluorescencia, sobre células en cultivo y secciones de biopsias cerebrales, utilizando anticuerpos específicos contra dichas proteínas.
- La distribución subnuclear de las distintas proteínas asociadas a DGPs en cada tumor, determinándose en qué estructura nuclear concreta se localizan: nucleolos, lámina nuclear, áreas de procesamiento de ARNm (‘nuclear speckles’), posible asociación a eucromatina, etc. Utilizaremos para ello técnicas de inmunocito/histoquímica sobre ambos materiales biológicos, utilizando anticuerpos contra dichas proteínas y marcadores de las distintas estructuras nucleares. En su caso, se llevará a cabo también hibridación in situ utilizando sondas de ARN específicas de estas últimas.
- Las proteínas con las que interactúa cada una de las proteínas asociadas a DGPs en el núcleo: DG, factores de transcripción, proteínas transductoras de señales, otras proteínas asociadas a DGPs, etc. Utilizaremos para ello técnicas de coinmunoprecipitación seguida de espectrometría de masas, llevadas a cabo sobre cultivos de las líneas tumorales.
- Los genes regulados por las distintas proteínas asociadas a DGPs, que podrían estar implicados en proliferación celular, metástasis, muerte celular (apoptosis), autofagia, etc. Utilizaremos para ello técnicas de inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación masiva de ADN (ChIP-Seq), llevadas a cabo sobre cultivos de las líneas tumorales.
Los datos obtenidos, se intentaría correlacionarlos con las características moleculares y celulares ya catalogadas de cada tumor cerebral: resistencia a radio y quimioterapia (con TMZ), índice de proliferación celular, grado y agresividad, metilación de promotores, mutaciones en otros genes del genoma, etc. Nos proponemos, con todo ello, por un lado, obtener información de primera magnitud sobre la función de estas proteínas en el núcleo de las células tumorales (“dime con quién andas y te diré quién eres”). Por otro lado, intentaremos establecer cuáles de estos genes podrían ser buenos marcadores de pronóstico (progresión y agresividad tumoral) y de respuesta a tratamiento, de cara a la clasificación molecular de los tumores y un mejor manejo clínico de los mismos. ¿A quién beneficia este proyecto?
Este proyecto se realizará en estrecha colaboración con el Hospital General Universitario de Elche, y está enfocado a tumores cerebrales de mal pronóstico sin una alternativa terapéutica actualmente conocida. Los principales beneficiarios serían, sin duda, los pacientes con este tipo de tumores (gliomas en general, y glioblastomas multiformes en particular) y sus familiares. Adicionalmente, se espera la generación de una base de conocimiento traslacional, que pueda resultar útil a la comunidad científica y a las compañías farmacéuticas, en relación al hallazgo de nuevas dianas moleculares y el desarrollo de nuevos tratamientos farmacológicos.
¿Qué precipitarás con tu ayuda?
Si se alcanzara el objetivo mínimo (3.000 €) estudiaríamos: i) los niveles de expresión de las proteínas codificadas por una serie de genes asociados a distrofias neuromusculares congénitas en el núcleo de células de glioblastomas multiformes, tanto en cultivos primarios como en secciones de biopsias cerebrales; ii) la localización subnuclear precisa de estas proteínas en dichas células.
Si lográsemos el objetivo óptimo de financiación (15.000 €) procederíamos a analizar: iii) los posibles genes diana regulados por estas proteínas y que podrían estar implicados en la progresión tumoral; iv) las proteínas con las que interaccionarían en el interior del núcleo de las células tumorales. Ello conduciría, esperamos, a la identificación de nuevos biomarcadores potenciales y proteínas diana de nuevos fármacos.
En caso de superarse la financiación óptima, se harían extensivos nuestros análisis, en principio realizados sobre un número limitado de glioblastomas, a toda la colección de tumores cerebrales (especialmente gliomas de grado III y IV) disponibles en los biobancos de los Hospitales Generales de Elche y Alicante (más de 100 pacientes). Ello permitiría obtener correlaciones entre nuestros resultados y el grado de malignidad, junto con otras características moleculares y celulares, de los distintos tumores.
Formamos parte de algo más grande
En nuestro grupo de la Universidad de Alicante, llamado Genética Humana y de Mamíferos (GHM), somos expertos en el estudio de genes y proteínas causantes de enfermedades neurodegenerativas poco frecuentes (raras) que afectan a la retina, tanto en tejidos sanos como en animales modelo de estos síndromes. En los últimos años nos hemos centrado en el estudio de los genes y proteínas asociados a DGPs, en los cuales una sola mutación afecta gravemente a la estructura y la función de los músculos, ojos y cerebro. Utilizamos para ello una amplia variedad de técnicas de biología molecular, celular y bioinformática, tanto de cara a su estudio a nivel individual como a gran escala (genómica y proteómica). Contamos para nuestras investigaciones no solo con las infraestructuras de nuestro Departamento, sino también de los Servicios Técnicos de nuestra Universidad, como son animalario, secuenciación de ADN, espectrometría de masas, cultivos celulares, microscopía confocal, análisis de imágenes y un largo etc.
En los últimos años colaboramos estrechamente con el Dr. Víctor Barberá, quien es profesor de nuestro Dpto. y miembro del Laboratorio de Genética Molecular del Hospital General Universitario de Elche. Este laboratorio es referencia para toda la Comunidad Valenciana en el diagnóstico genético de distintos síndromes hereditarios de cáncer. Hemos realizado hasta la fecha interesantes avances en la detección de alteraciones en la expresión génica en glioblastomas, así como en la identificación de nuevos biomarcadores de utilidad clínica en el diagnóstico y pronóstico de los tumores cerebrales humanos.
Nuestro grupo también mantiene colaboraciones activas desde hace años, entre otros, con el grupo de investigación Genética Molecular de las Distroglicanopatías, dirigido por el Dr. Jesús Cruces en la Universidad Autónoma de Madrid. En dicho grupo se identificó el primer gen asociado a este tipo de enfermedades, llamado POMT1, y es actualmente laboratorio de referencia en España para el estudio y diagnóstico molecular de estas patologías. Es destacable asimismo nuestra interacción con el grupo llamado Modelos Animales por Manipulación Genética, dirigido por el Dr. Lluis Montoliu en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC en Madrid. Este grupo es especialista en la generación y caracterización de animales modelo de numerosas enfermedades raras humanas, entre ellas trastornos oculares como el albinismo, con la idea de desarrollar nuevas terapias para futuros tratamientos.
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